海洋酵母菌Metschnikowia reukaufii W6b酸性蛋白酶的生产、基因克隆和表达的研究

【摘要】： 从海洋中分离的近400株酵母中筛选出1株产酸性蛋白酶的海洋酵母菌W6b,并初步确定该酶为细胞结合蛋白酶,命名为SAP6。通过酵母鉴定的常规方法并结合分子生物学方法,对该菌株进行鉴定,鉴定结果为鲁考弗美奇酵母(Metschnikowia reukaufii)。 研究了菌株W6b的合成酸性蛋白酶的培养条件,产酶的最适条件为葡萄糖1%、酪蛋白1.5%、酵母粉0.5%、海水配制,培养基初始pH为pH5.0,接种量为7.5×10~7个细胞/50mL发酵培养基,28℃、140rpm振荡培养,在上述条件下培养48h酸性蛋白酶酶活最高可达到72.5U/mL。粗酶的最适作用温度为40℃,最适作用pH为3.4。 利用简并PCR与SMART RACE PCR克隆到了该酸性蛋白酶基因SAP6。基因SAP6的cDNA全长序列为1755 bp,SAP6基因组序列中没有内含子,含开放阅读框(ORF)1527 bp,编码508个氨基酸,蛋白酶前体分子量为53486Da。推导的SAP6氨基酸序列与米曲霉(Aspergillus oryzae)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和近平滑假丝酵母(Candida parapsilosis)的酸性蛋白酶氨基酸序列相似度分别为18.11%、20.52%和28.6%。通过分子生物学软件分析,基因SAP6有一个含16个氨基酸残基的信号肽序列,一个真核Asartyl(acid)蛋白酶家族(EC 3.4.23)序列特征的保守区,两个真核和病毒(Eukaryotic and viral)天冬氨酸活性位点,6个N-糖基化位点。Kyte和Doolittle疏水性分析显示SAP6与酿酒酵母细胞壁锚定的酸性蛋白酶具有高度相似的GPI-锚定结构。 将cDNASAP6克隆到大肠杆菌pET-24a(+)表达载体中,构建了表达载体pET-24a(+)SAP6,在大肠杆菌BL21(DE3)中利用IPTG进行诱导表达,重组蛋白通过SDS-PAGE和Immunoblotting鉴定分子量为54kDa,重组酸性蛋白酶粗酶液与SAP6一样具有牛奶凝固特性和水解蛋白形成透明圈的能力,证明克隆到的基因SAP6确实为酸性蛋白酶基因。这是关于美奇酵母属酸性蛋白酶基因克隆和表达的首次研究报导。 通过Ni柱亲和层析法对重组酸性蛋白酶进行了纯化,纯化的重组蛋白通过SDS-PAGE和Immunoblotting鉴定分子量为54kDa。重组酸性蛋白酶的最适作用温度是40℃,在40℃以下重组酶的热稳定性较好,40℃以上酶活迅速下降;最适pH为3.4,在pH 2.6～5.0范围内有较好的稳定性。Mn~(2+)对重组酶的活性有轻度的激活作用,Cu~(2+)对重组酶的活性有较大的抑制作用,与已报导的酵母菌和霉菌酸性蛋白酶差异明显,表明SAP6可能为新型酸性蛋白酶。重组酶明显受Pepstatin的抑制,EDTA基本对重组酶活性无抑制作用;PMSF和碘乙酸对重组酶活力基本无影响,SDS可部分抑制酶的活力,说明重组酶为天冬氨酸蛋白酶。