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《中国海洋大学》 2009年
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几种重要海水养殖鱼类细胞系的建立、诱导分化及其应用研究

王贤丽  
【摘要】: 鱼类细胞系的建立始于上世纪60年代,由Wolf和Quimby建立了世界上第一个鱼类细胞系-虹鳟生殖腺细胞系RTG-2。随后,鱼类细胞培养工作取得了较大的进展,一些细胞系相继建立成功。鱼类细胞系因材料容易获得、成本低、重复性好、实验条件可以精确控制等优点,至今已成为一种重要的研究手段,广泛应用于鱼类病毒学等各方面研究。对鱼类细胞系进行深入研究无论在理论研究方面还是在实际应用方面都具有深远意义。 本论文研究了半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)心肌细胞系(HTHC)和圆斑星鲽(Verasper variegates)肾脏细胞系(SHKC)的建立;同时还对半滑舌鳎胚胎细胞系(HEC)和日本牙鲆(Paralichthys olivaceus )胚胎细胞系(FEC)进行了干细胞功能的诱导分化;并将大菱鲆胚胎细胞(TEC)应用于大菱鲆GRIM19基因的功能研究工作上。半滑舌鳎心肌细胞系和圆斑星鲽肾脏细胞培养在添加有20% FBS,1 mM的L-谷氨酸,50 mM的2-ME,100 UI/ml青霉素,100 ug/ml链霉素,10 ng/ml bFGF的MEM培养基中,两种细胞的形态均为成纤维样细胞。HTHC细胞至今已传代30余代;SHKC细胞至今已传代40余代。本实验检测了FBS、bFGF、温度对HTHC和SHKC细胞生长的影响。在一定范围内,细胞生长速度随FBS浓度的增高而加快,FBS浓度过高或过低都抑制细胞的增殖。bFGF对HTHC细胞生长具有刺激作用。HTHC和SHKC细胞在24-30℃之间细胞生长良好,当温度高于30℃或低于12℃时,细胞生长速度降低。HTHC细胞的二倍体核型为2n=42;SHKC细胞的的二倍体核型为2n=46,将EGFP报告基因通过脂质体(lipofectamine2000)介导的方法成功转入HTHC和SHKC细胞中并获得了表达,转化率为10-15%左右。用牙鲆淋巴囊肿病毒(LCVD)感染HTHC和SHKC细胞,观察到了细胞病变效应(CPE),透射电镜检测均在细胞内发现了大量病毒颗粒。 半滑舌鳎胚胎细胞系(HEC)和日本牙鲆胚胎细胞系(FEC)为本实验室建立保存。HEC和FEC都具有发育上的多能性,在特定的诱导条件下,都可以诱导分化为纤维细胞、肌肉细胞、神经细胞等各种类型的细胞。全反式视黄酸(RA)、明胶、低浓度FBS均可以诱导两种胚胎细胞分化为纤维细胞;二甲基亚砜和低密度种植HEC细胞均可以诱导HEC细胞分化为树状肌肉细胞;HEC和FEC细胞在低密度条件下均分化为神经细胞、肌肉细胞、上皮细胞;HEC和FEC细胞碱性磷酸酶染色均呈阳性,这些结果初步表明HEC和FEC胚胎细胞具有干细胞的分化特征。将EGFP报告基因通过脂质体(lipofectamine2000)介导的方法成功地转入HEC和FEC中并获得了表达;用牙鲆淋巴囊肿病毒(LCDV)感染HEC和FEC细胞,观察到了细胞病变效应(CPE),通过透射电镜观察到在细胞内有大量病毒颗粒。 我们从大菱鲆脾脏cDNA文库中鉴定出一GRIM19基因,并得到该基因的DNA全长。利用RT-PCR技术对该基因进行了在大菱鲆正常组织、不同胚胎发育阶段、鳗弧菌(Vibrio anguillaru,ATCC19019)感染组织和细胞中的表达分析,初步探讨了GRIM19基因在鱼类先天免疫系统中作用。实验结果表明:GRIM19全长cDNA含有一个17 bp的5'UTR,一个435 bp的开放阅读框(open reading frame,ORF)和一个143 bp的3'UTR,开放阅读框编码了144个氨基酸残基。通过比较cDNA序列和基因组序列发现GRIM19基因内含有5个外显子和4个内含子。基因组Southern结果表明该基因为单拷贝基因。系统发生分析表明大菱鲆能够与大西洋庸鲽聚在一起。该基因在正常大菱鲆免疫系统中表达强烈,尤其是在脾脏和头肾中;GRIM19在大菱鲆胚胎不同发育时期表达逐渐增强;在感染头肾、肝脏、脾脏三种组织中,该基因表达均有增加趋势:在感染头肾中该基因表达最强烈,在肝脏感染24 h时基因表达达到最高水平,而在脾脏中该基因表达一直增强;鳗弧菌感染大菱鲆胚胎细胞后,GRIM19基因表达上调。GRIM19基因在濒临死亡的大菱鲆成体鱼肝脏、头肾、心脏和脾脏中的表达均增强。这些结果表明GRIM19基因在大菱鲆免疫应答中起着重要作用。
【学位授予单位】:中国海洋大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2009
【分类号】:S917.4

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【引证文献】
中国硕士学位论文全文数据库 前6条
1 郭雪阳;两种星鲽组织细胞系的建立及三丁基氧化锡对其毒性作用的研究[D];中国海洋大学;2010年
2 李文峰;大菱鲆(Scophthalmus maximus)体细胞培养及其在病毒研究中的应用[D];中国海洋大学;2010年
3 陆维;贝类遗传育种分析评估系统的应用研究[D];中国海洋大学;2011年
4 冯为慧;淡水鱼类细胞现采现培技术的初步建立与关键技术点研究[D];南昌大学;2012年
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6 王小刚;点带石斑鱼精子种质保存研究[D];海南大学;2010年
【参考文献】
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【共引文献】
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10 贾方钧,王铁辉,张义兵,俞小牧,李戈强;干扰素防治草鱼出血病的效果初探[J];水产科学;2000年04期
中国重要会议论文全文数据库 前4条
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2 郑在予;;欧洲鳗鲡组织细胞体外培养初步研究[A];2008年福建省科协第八届学术年会农业分会场论文集[C];2008年
3 尹洪滨;薛淑群;;鱼类细胞核移植研究进展及意义[A];全国首届动物生物技术学术研讨会论文集[C];2004年
4 宋晓平;窦忠英;雷安民;华进联;杨学义;马勇江;;小鼠成骨细胞条件培养基的制备[A];全国首届动物生物技术学术研讨会论文集[C];2004年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 于红;牡蛎良种选育的遗传学基础研究[D];中国海洋大学;2010年
2 孙爱;大黄鱼(Pseudosciaena crocea)三种组织细胞系的建立、鉴定及其应用的初步研究[D];中国海洋大学;2010年
3 梁洋;蜘蛛拖丝蛋白基因Spidroin1嵌合体小鼠的研究[D];东北林业大学;2011年
4 王慧娟;pEGFP-N2-BMP2转染P19细胞诱导向心肌分化[D];河北医科大学;2011年
5 孙德毅;人骨髓间充质干细胞与骨诱导活性材料构建组织工程骨的实验研究[D];中南大学;2011年
6 符贵红;草鱼细胞色素P4503A和孕烷X受体基因表达分析及其功能初步研究[D];上海海洋大学;2011年
7 辛晓玲;特定转录因子诱导新生牛成纤维细胞为多能性干细胞的研究[D];西北农林科技大学;2011年
8 邹远超;匙吻鲟雌核发育诱导及其相关机制研究[D];华中农业大学;2011年
9 樊彦红;黄曲霉毒素B_1和脱氧雪腐镰刀菌烯醇对锦鲤及原代培养肝细胞的毒性研究[D];南京农业大学;2008年
10 郭华荣;海水鱼细胞系FG、SPH和RSBF的特性分析及其在典型海洋污染物毒性检测上的应用[D];中国科学院海洋研究所;2001年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 王树云;斑点叉尾鮰病毒ORF6和ORF10基因的原核表达及其功能的初步研究[D];华中农业大学;2010年
2 呼光富;颖鲤杂种优势及其相关分子生物学初步研究[D];华中农业大学;2010年
3 景毅;条斑星鲽(Verasper moseri)卵巢细胞系的建立及几种内分泌干扰物对其生殖与遗传毒性作用的研究[D];中国海洋大学;2010年
4 郭雪阳;两种星鲽组织细胞系的建立及三丁基氧化锡对其毒性作用的研究[D];中国海洋大学;2010年
5 徐晓辉;两种星鲽组织细胞系的建立及久效磷对其毒性作用的研究[D];中国海洋大学;2010年
6 李文峰;大菱鲆(Scophthalmus maximus)体细胞培养及其在病毒研究中的应用[D];中国海洋大学;2010年
7 曹锴;草鱼脂肪细胞原代及传代培养[D];重庆师范大学;2011年
8 朱霞;框镜鲤原代细胞培养和锦鲤疱疹病毒的分离鉴定[D];吉林农业大学;2011年
9 谢丹丹;体外心肌样微环境诱导P19细胞向心肌细胞分化[D];河北医科大学;2011年
10 廖高鹏;黄鳝Fucal基因克隆及SSEA与Fucal在黄鳝性腺组织中的分化表达[D];湖南师范大学;2011年
【同被引文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 崔莹莹;吴东明;李月红;付云红;;鲤鱼上皮细胞在不同培养条件下的生长状况及与哺乳动物细胞的比较[J];安徽农业科学;2010年24期
2 刘星;仇雪梅;高祥刚;赫崇波;;基因文库构建及其在鱼类遗传研究上的应用[J];现代农业科技;2008年16期
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6 王铁辉,张义兵,李戈强,易泳兰,刘汉勤,朱作言;鱼类培养细胞干扰素的诱导[J];病毒学报;1999年01期
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9 郑莲,刘楚吾;4种石斑鱼亲缘关系的RAPD分析[J];水产科学;2004年11期
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中国重要会议论文全文数据库 前1条
1 郑在予;;欧洲鳗鲡组织细胞体外培养初步研究[A];2008年福建省科协第八届学术年会农业分会场论文集[C];2008年
中国博士学位论文全文数据库 前9条
1 孙爱;大黄鱼(Pseudosciaena crocea)三种组织细胞系的建立、鉴定及其应用的初步研究[D];中国海洋大学;2010年
2 郭华荣;海水鱼细胞系FG、SPH和RSBF的特性分析及其在典型海洋污染物毒性检测上的应用[D];中国科学院海洋研究所;2001年
3 邓岳文;皱纹盘鲍数量遗传与育种研究[D];中国科学院研究生院(海洋研究所);2005年
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5 朱丽岩;几种环境内分泌干扰物对青岛近海常见海洋动物的毒性效应[D];中国海洋大学;2005年
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7 任国诚;几种重要海水养殖鱼类细胞系的建立、鉴定及应用[D];中国海洋大学;2007年
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9 魏云波;褐点石斑鱼(Epinephelus fuscoguttatus)三种细胞系的建立、病毒敏感性以及环境污染物对其毒性作用的研究[D];中国海洋大学;2009年
中国硕士学位论文全文数据库 前7条
1 李艳;贝类遗传评估体系的建立研究[D];中国海洋大学;2010年
2 李红蕾;栉孔扇贝中分子遗传标记的研究及应用[D];中国科学院研究生院(海洋研究所);2003年
3 陈雄芳;大黄鱼精子和胚胎的超低温保存研究[D];中国海洋大学;2004年
4 刘清华;真鲷(Pagrosomus major)精液超低温保存及其低温损伤研究[D];中国海洋大学;2005年
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7 孔祥婷;黄颡鱼细胞培养研究[D];苏州大学;2009年
【二级参考文献】
中国期刊全文数据库 前10条
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【相似文献】
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10 朱楚洪;应大君;张伟;董世武;魏勇;;骨髓干细胞诱导分化成内皮细胞的实验研究[A];解剖学杂志——中国解剖学会2002年年会文摘汇编[C];2002年
中国重要报纸全文数据库 前10条
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3 本报记者  冯华;大洋里“游”来多宝鱼[N];人民日报;2006年
4 本报记者 张在杰 通讯员 胡鹰 马宗伶;莱州农民养殖大菱鲆致富的秘密[N];山东科技报;2010年
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7 英杰;大菱鲆养殖之路何去何从[N];江苏农业科技报;2006年
8 本报记者 刘杰;大菱鲆养殖之路何去何从[N];山东科技报;2006年
9 刘广杰;昌邑大菱鲆实现无公害生产[N];中国渔业报;2004年
10 马学信 郭敏;山东大菱鲆产业喜忧录[N];中国渔业报;2006年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
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5 闫迎军;应用脂肪干细胞与脱细胞真皮构建组织工程皮肤[D];中国协和医科大学;2007年
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7 朱敏洁;人参皂甙Rg1诱导胚胎干细胞分化为心肌样细胞和在胚胎干细胞迁移中的作用[D];华中科技大学;2008年
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9 史明艳;山羊毛囊干细胞及组织工程皮肤构建研究[D];西北农林科技大学;2006年
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中国硕士学位论文全文数据库 前10条
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3 赵美子;大鼠骨髓源性间充质干细胞定向诱导分化为肝细胞的实验研究[D];吉林大学;2007年
4 段祥;骨髓间充质干细胞向神经细胞、成骨细胞诱导分化的研究[D];苏州大学;2007年
5 张钰;体外诱导人胎盘间充质干细胞分化为软骨细胞的实验研究[D];中国医科大学;2008年
6 刘智全;不同接种密度培养胎鼠脊髓神经前体细胞的实验研究[D];大连医科大学;2008年
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10 张紫娟;神经干细胞体外培养及分化过程中钾电流的变化[D];郑州大学;2006年
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