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《中国海洋大学》 2009年
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解脂耶罗威亚酵母菌表面展示质粒的构建及应用的初步研究

岳礼溪  
【摘要】: 以分泌型表达载体pINA1317为基础,分别借助解脂耶罗威亚酵母菌(Yarrowia lipolytica)细胞壁蛋白YlCwp1 C端的131个氨基酸和C端的110个氨基酸,构建了Y. lipolytica表面展示质粒,我们将其分别命名为pINA1317-ylcwp131和pINA1317-ylcwp110。利用新构建的表面展示质粒成功展示了报告蛋白——增强型绿色荧光蛋白(EGFP),展示EGFP的细胞占到观察的细胞总数的100%。用本研究构建的质粒展示外源蛋白不需特殊物质诱导,宿主菌进入生长的稳定期后开始表达。 利用pINA1317-ylcwp110分别成功展示了来源于真菌奥默柯达酵母菌(Kodamaea ohmeri)BG3的植酸酶和来自细菌哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)SF-1的溶血素蛋白,得到了具有相应活性的菌株,免疫荧光实验结果证明目的蛋白已经展示在Y. lipolytica表面。 为了比较表面展示植酸酶与游离植酸酶的异同,利用pINA1317表达载体将K. ohmeri BG3的植酸酶在Y. lipolytica中进行了表达,得到了分泌游离植酸酶的菌株,并利用Ni2+亲和层析对重组酶进行了纯化。SDS-PAGE及Western blotting鉴定结果表明重组酶的分子量约为65.1 kDa;小于天然酶的分子量(98.2 kDa)而大于在大肠杆菌中表达的重组酶分子量(51.0 kDa)。重组酶基本保持了天然酶的性质。表面展示的植酸酶在60.0℃,pH 5.0时酶活是114.7 mU/mg菌体干重。表面展示的植酸酶与天然酶和Y. lipolytica中表达的游离酶相比,最适作用温度由65.0℃降低至60.0℃。与天然植酸酶相比,表面展示酶对温度更为敏感,但与Y. lipolytica中表达的游离酶相比,温度稳定性提高。表面展示植酸酶与另外两者相比,pH稳定范围缩小,在pH3.0~8.0能够保持稳定;最适作用pH范围拓宽,在pH4.0~6.0之间酶活力较高且酶活力相差不大。金属离子对表面展示植酸酶的激活或抑制作用与天然酶及游离重组酶一致,但是作用效果减弱。 毒性实验结果表明,表面展示有哈维氏弧菌溶血素蛋白的活的Y. lipolytica对大西洋牙鲆幼鱼是安全的。将该菌株作为活疫苗以5.0×108 cells/ml的浓度免疫大西洋牙鲆幼鱼,每尾0.2ml,并于初次免疫后第7 d和第21 d分别加强免疫;最后一次免疫后第7 d取血,间接ELISA检测到了大西洋牙鲆血清中溶血素特异抗体的产生。 由于间接ELISA检测的需要,本研究采用Ni2+亲和层析纯化了在大肠杆菌中表达的重组V. harveyi溶血素,纯化的溶血素具有溶血活性,分子量大小约为45.0kDa;HiTrap rProteinA Sepharose亲和层析纯化了大西洋牙鲆免疫球蛋白IgM,SDS-PAGE结果表明纯化的IgM重链和轻链的大小分别是74.5 kDa和26.3 kDa,这是关于大西洋牙鲆免疫球蛋白IgM的首次报道。利用本研究纯化的IgM制备了小鼠抗大西洋牙鲆IgM多克隆抗体,免疫斑点法测定抗体效价达到1:3200以上。 如果进一步改造菌株,增加目的蛋白质在Y. lipolytica表面的表达量,同时减少酵母菌表面其他蛋白质的量,那么该表面展示质粒可以应用于固定化酶、生物转化、生物修复、活疫苗和超高通量筛选等方面。
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