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《中国海洋大学》 2009年
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文昌鱼Legumain基因的克隆、表达和功能研究

滕蕾  
【摘要】: 半胱氨酸蛋白酶(EC3.4.22)是一类催化活性位点含有亲核的半胱氨酸残基的肽链内切酶。Legumain(C13)(EC3.4.22.34),又称天冬酰胺內肽酶(asparaginyl endopeptidase,AEP),是半胱氨酸蛋白酶家族新成员。近年来,在植物、寄生虫及哺乳动物中对于Legumain基因、蛋白的结构和功能研究都取得了一定程度的进展。但是,却未见文昌鱼的Legumain基因或蛋白的相关报道。文昌鱼是现存的与脊椎动物原始祖先最接近的头索动物,一直被认为是研究脊椎动物起源和进化的模式动物。本文克隆了青岛文昌鱼(Branchiostoma belcheri tsingtaunese)的具有完整开放阅读框的Legumain基因(BbLGMN),并对其结构、进化、表达和功能进行了研究。 首先,克隆得到一个全长1 637 bp的cDNA序列,其开放阅读框为1 308 bp,编码一个435个氨基酸残基的多肽链,理论分子量约48.9 kDa。氨基末端有一个由15个氨基酸残基组成的信号肽。内部有一个肽酶C13超家族结构域。结构域内有一个His153和Cys195催化二联体和一个保守的KGD (Lys123-Gly124-Asp125)基序。多个高度保守的半胱氨酸残基分别位于第226、386、398、418及435位。与曼氏血吸虫、长角血蜱、海鞘、斑马鱼、非洲爪蟾,牛,人的Legumain的同源性分别为36.6%、45.9%、46.1%、49.8%、49.4%、47.1%和48.5%。系统进化分析显示BbLGMN和海鞘的Legumain独聚一支,位于脊椎动物的基部,提示文昌鱼Legumain基因可能是脊椎动物Legumain基因的原祖型。 其次,采用毕赤酵母X-33真核表达系统得到50 kDa的rBbLGMN,进而对蛋白的生物学特征进行研究。发现rBbLGMN及内源性的BbLGMN都能在酸性条件下,在Asn347位点自切去除C末端肽段,形成分子量大小为37 kDa的有活性的成熟酶,能特异性切割多肽链中天冬酰胺残基羧基端的肽键。而在中性及碱性环境中就会失去自切及对特异性底物(Z-Ala-Ala-Asn-MCA)的酶切活性;成体文昌鱼肝盲囊中内源性BbLGMN在pH5.5的缓冲环境中活性最高。rBbLGMN的活性,能被碘乙酰胺及N-乙基顺丁烯二酰亚胺抑制;被蛋清半胱氨酸蛋白酶抑制剂部分抑制,却不被苯甲基磺酰氟化物,胃酶抑素A和E-64抑制。 再者,我们研究了BbLGMN在成体文昌鱼各组织中的表达情况。内源性酶活性检测及Western blot分析结果都表明BbLGMN蛋白主要在肝盲囊及后肠表达,Northern blot和qRT-PCR分析也进一步证明了这一点。文昌鱼BbLGMN呈现出组织特异性表达模式。文昌鱼的肝盲囊被认为是哺乳动物的肝脏和胰脏的起源。Legumain在文昌鱼消化道内呈现的组织特异性分布提示这种酶可能和食物大分子的降解有关。 最后,鉴于哺乳动物Legumain参与机体免疫过程中抗原的加工与递呈,我们对BbLGMN在免疫方面的功能进行了初步探讨。在LPS处理文昌鱼后,BbLGMN的表达量增加,提示BbLGMN可能参与了文昌鱼的免疫防御,但是BbLGMN却没有抑菌作用。 所以,BbLGMN在消化道内可能主司食物大分子的降解消化,关于它是否参与文昌鱼体内的免疫过程,尚不能确定。
【学位授予单位】:中国海洋大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2009
【分类号】:S917.4;Q78

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