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《中国海洋大学》 2009年
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金鱼卵黄原蛋白多克隆抗血清的制备及在农药环境雌激素活性筛选中的应用

于坤  
【摘要】: 我国是农药生产、使用大国,20世纪90年代中期以来每年生产农药50万t以上,使用量40万t以上,并成逐年上升趋势,其中约80%的农药使用后直接进入环境,造成了严重的环境污染。多数农药不仅对生物具有强的毒性作用,甚至对内分泌系统具有扰乱作用。在已确认的具有环境雌激素活性的化学物质中,农药所占比例较大,1999年世界自然基金会报告的125种环境雌激素中,农药有86种,占68.8%。因此,有必要建立农药环境雌激素活性的筛选评价体系,以减少其对环境的危害。目前,国内外比较成熟的环境雌激素筛选评价体系主要包括鱼类卵黄蛋白原(vitellogenin,Vtg)诱导实验法、重组基因酵母检测法和酵母双杂交法等。其中,雄性鱼类Vtg作为检测环境雌激素的重要生物标志物,已得到广泛的应用。但是Vtg的定性和定量依赖于Vtg抗体的制备。由于不同鱼种间Vtg具有较高的种间差异性,因此需要制备不同的抗体测定Vtg。在本实验室的前期工作中已经制备了兔抗金鱼多克隆抗血清,为进一步提高抗体的特异性,本研究以金鱼为模式生物,制备了鼠抗金鱼Vtg多克隆抗血清,并用western-blot技术对8种常用农药的环境雌激素活性进行了筛选。研究结果表明: 腹腔注射0.05 mg/g(BW)17β-雌二醇(E2),诱导金鱼2周后尾静脉取血,离心分离得到的血浆,经凝胶过滤层析(分子筛)和离子交换两步法进行分离、纯化。native-PAGE结果表明,纯化的血浆样品可被考马斯亮蓝、糖、磷、脂蛋白同时染色,确定为Vtg,在非变性条件下电泳检测其分子量约为460 kDa,经SDS-PAGE得到分子量分别为130、106、81和54 kDa的4个亚基。 采用纯化的金鱼Vtg腹腔注射小白鼠进行免疫,免疫周期为6周。首次免疫两周后进行第2次免疫,以后每周注射1次,连续注射3周,每只小白鼠每次注射量均为50μg纯化金鱼Vtg (等体积抗原与弗氏完全佐剂充分混匀),于第5次注射后,在1周内连续注射抗原2次以加强免疫效果,采血分离获得抗血清。采用双向免疫扩散法,测得制备的鼠抗金鱼Vtg多克隆抗血清效价至少为1:16;采用蛋白印迹法(Western blot)对多克隆抗血清的特异性进行检测,表明在1:500倍稀释条件下对金鱼Vtg的最低检出限为1μg/L。 利用制备的鼠抗金鱼Vtg多克隆抗血清作为第一抗体,辣根酶标记羊抗鼠IgG作为第二抗体,采用Western-blot方法定性检高效氯氰菊酯、三唑酮、溴甲维磷、氧乐果、敌敌畏、久效磷、灭多威和草甘膦等8种农药的环境雌激素活性。结果表明:0.01 mg/L、0.1 mg/L和1.0 mg/L氯氰菊酯、三唑酮、溴甲维磷、氧乐果、敌敌畏、久效磷6种农药暴露组的雄性金鱼血浆均能与鼠抗金鱼Vtg抗血清发生阳性反应,表明它们能够诱导雄性金鱼合成和分泌Vtg,具有环境雌激素活性;灭多威和草甘膦则未检测到阳性反应,表明未能诱导雄性金鱼分泌Vtg,可能不具有环境雌激素活性。 综上,本研究用E2诱导金鱼产生Vtg,分离纯化后得到Vtg纯品;用此Vtg纯品对小白鼠进行免疫,获得鼠抗金鱼Vtg多克隆抗血清;并利用制备的多克隆抗血清对8种常用农药的环境雌激素活性进行了筛选。结果表明:分离纯化得到的金鱼Vtg纯度较高;所制备的鼠抗金鱼Vtg多克隆抗血清对金鱼Vtg具有较好的特异性;高效氯氰菊酯、三唑酮、溴甲维磷、氧乐果、敌敌畏、久效磷等6种农药可能具有环境雌激素活性;灭多威和草甘膦可能不具有环境雌激素活性。
【学位授予单位】:中国海洋大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2009
【分类号】:X839.2

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【引证文献】
中国硕士学位论文全文数据库 前1条
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【参考文献】
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