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《中国海洋大学》 2009年
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小鼠法和高效液相色谱法测定野生河鲀不同组织内河豚毒素的含量

殷芹  
【摘要】: 从我国丹东、青岛和南通采集了四种野生河豚鱼样本,分别是红鳍东方豚、黄鳍东方豚、假睛东方豚和菊黄东方豚,用小鼠单位法和高效液相法检测不同组织内河豚毒素(Tetrodotoxin简写为TTX)的含量。 小鼠法是最早建立的河豚毒素检测标准,由上世纪40年代美国学者建立。原理是根据小鼠死亡时间倒数与单位体重接受毒素量成正比关系,建立小鼠死亡时间倒数-河豚毒素剂量曲线,通过相应系数换算便可查知样品毒素含量的方法。目前这一方法仍是日本官方检测河豚毒素的方法。此法测得的毒力用小鼠单位(mouse unit,MU)表示,1MU是指30分钟杀死一只20克雄性ddy小鼠的毒素量(1MU=0.22μg河豚毒素)。小鼠法检测结果是,河豚鱼体不同部位检测到的河豚毒素的含量是不同的,卵巢的毒力最大,其次为肝脏,皮肤的毒力略大于肌肉,其中皮肤和肌肉暂时定为无毒,但由于受采样季节及捕获的河豚鱼种类及数量的限制,部分统计数据仍需进一步完善,同一地域同一种类的河豚鱼在不同的年份含毒量及有毒率也存在很大差异。小鼠法检测平均回收率为86.35%-88.03%,肝脏的毒力范围是0-171.20 MU/g,卵巢的毒力范围是0-739.68 MU/g,皮肤和肌肉的毒力范围是1-10 MU/g。 对TTX的高效液相色谱法(HPLC)检测,样品的前处理是关键,主要涉及提取和纯化过程中的回收率和除杂效果。以往的文献报道中,河豚鱼组织中的TTX经醋酸溶液提取后,首先以吸附性很强的物质来除去提取液中的杂质,虽然这些物质具有较好的除杂质效果,但它们对河豚毒素的吸附能力也很强,而且不易洗脱和回收,操作繁杂,不可避免的造成毒素的回收率偏低。然后过截留分子量为1000的超滤膜或Bio-Gel P-2分子筛层析柱去除大分子物质,上阳离子交换树脂2-3遍吸附河豚毒素和去除氨基酸,酸洗脱液冷冻干燥。最终样品是得到很好的净化,但回收率过低,较难用于HPLC法的TTX定量分析。在本实验中使用活化的SPE HLB固相萃取小柱柱替代繁琐低效的纯化过程,小柱经甲醇、水活化后,经HPLC法验证,TTX峰与周围杂质分离良好,基质大大减少,回收率亦令人满意,达到了预期纯化效果。 本次实验以离子对磷酸缓冲盐为流动相,联合PDA检测的反相高效液相色谱方法定量分析河豚毒素。方法:WATERS600E液相系统,PDA996二极管矩阵检测器;色谱柱Hypersil ODS C18(i.d 4.6×200mm 5μm,大连依利特公司);流动相0.05mol/LNaH2PO4:0.05mol/LNa2HPO4=1:1(v/v),庚烷磺酸钠离子对5mmol/L;流速0.6ml/min;检测波长205nm;柱温25℃;进样量20μL。结果线性回归方程:y=6228.7x–6713,TTX的线性范围为2.5mg/L─100mg/L,最小检出限为40ng,相关系数为0.9998,回收率为91.42%-94.39%,RSD为2.16-3.14%。该方法灵敏、快速、准确,适用于河豚鱼中河豚毒素的定量检测。
【学位授予单位】:中国海洋大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2009
【分类号】:S917.4

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