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纳米筒状血红素酶的仿生构建及其催化氧化性能和应用研究

王超  
【摘要】:生物体系中的催化氧化由金属酶催化,在常压、室温和水相的条件下进行,这完全符合绿色化学的理念。自本世纪初以来,许多科学家致力于构建具有催化活性的人工金属酶。而在众多的构建方法中,利用主客体相互作用的方法将客体血红素直接引入到主体蛋白中,是目前最为简单直接的方法之一,利用该方法构建的酶称之为人工血红素酶。但是由于蛋白质结构与性质的差异,以及对客体分子结合力的不同,该方法还存在很多问题,如重组体系结构稳定性及功能性不高,选择特异性不突出,理论研究不彻底等。我们仍需要进行更多的人工酶合成及功能化方面的研究,以得到稳定性更好、功能性更完善、催化活性更高的人工酶,扩展其在生物分析和环境监测等方面的应用。本论文主要对人工血红素酶的合成、性质进行了研究,并对其实际应用价值进行了探索。本研究中选用的主题蛋白是伴侣素Gro EL,它是由两个七元环背对背堆叠形成的直径约为13.7nm,长度约为14.6nm的圆筒状结构十四聚体蛋白质复合物,其功能是辅助错误折叠的蛋白进行正确的折叠。在本研究中,它一方面可以作为结合血红素的载体,另一方面可以作为纳米尺度的反应容器。主要内容概述如下:1)本论文通过表面活性剂透析法,利用GroEL和催化活性中心血红素Hemin,合成了具有类过氧化物酶活性的人工金属酶,并考察了温度、p H值、浓度对酶活的影响,以及人工酶的稳定性。Gro EL有效地分散并固定了Hemin分子,并且Gro EL的分子结构没有明显的改变。构建的Hemin-Gro EL人工酶在适宜条件下具有较高的酶活性,并且在催化实验中,其动力学行为遵循乒乓机制。2)使用3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)和邻苯二胺(OPD)等模型底物,成功建立了基于Hemin-Gro EL人工酶的比色检测方法。通过比色反应的动力学分析,发现Hemin-Gro EL同样具有类过氧化物酶活性,同时遵循典型的米氏动力学和乒乓机制。基于Hemin-Gro EL的比色检测实验可以实现对溶液中H2O2和葡萄糖的检测。此外,该人工酶也可以用于儿茶酚的氧化去除,为临床分析和环境检测等应用提供了重要的参考依据。3)利用荧光底物高香草酸(HVA)成功建立了基于Hemin-Gro EL人工酶的荧光检测方法。经过荧光反应的动力学和底物的竞争性抑制实验分析,表明Hemin-Gro EL人工酶的底物特异性不强,可降低甚至消除其底物抑制作用。Hemin-Gro EL的荧光检测实验,表明该人工酶不仅可以对溶液中H2O2、葡萄糖进行测定,还可用于相关底物酶的检测,如葡萄糖氧化酶,是极具潜力的新型人工酶。


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