打结蛋白1O6D的去折叠过程研究

【摘要】：经典的蛋白质折叠理论认为蛋白质中一般都不会形成复杂的拓扑结构,但随着计算机模拟技术、NMR以及X-Ray技术的发展,越来越多的打结蛋白不断被发现。研究表明打结结构不仅对蛋白质的结构和功能发挥着非常重要的作用,其对遗传疾病的治疗和生理活动的调控也有着重要的生物学影响。然而目前对于打结蛋白的折叠机理、以及打结结构对于蛋白质的折叠过程有着怎样的影响仍不清楚。本论文以打结蛋白1O6D为研究对象,并对1O6D去折叠过程中热力学和动力学进行研究,以完善蛋白质的折叠机理。(1)利用大肠杆菌表达体系制备了高纯度1O6D野生型蛋白质并对其进行了初步表征。SDS-PAGE和质谱分析表明所制备的1O6D蛋白相对分子质量为19112.12 Da,与理论分子质量一致。圆二色谱表征结果显示1O6D野生型蛋白质表现出明显的α螺旋结构,这与文献报道一致。化学变性滴定表明野生型1O6D蛋白的半数变性浓度(D_(50%))为4.05 mol/L GdnCl。温度变性实验表明野生型1O6D蛋白质的热稳定性较好,在80℃下其二级结构与室温条件下基本相同。动力学实验表明1O6D的去折叠包括慢速和快速两个过程。(2)用环状PCR技术成功构建了5个1O6D色氨酸定点插入突变体。通过SDS-PAGE和质谱检测证实突变体的实际相对分子质量与其理论值相符。圆二色谱实验表明,突变体的二级结构与野生型基本一致。化学滴定实验表明突变体的D_(50%)均低于野生型1O6D,通过计算各突变体的?G~0,发现野生型1O6D结构最稳定,而F120W和F84W突变体的稳定性都较差。温度变性滴定研究发现,F68W和Y106W的热稳定性与野生型类似,而F84W和F120W的热稳定性有明显的降低,这与化学变性滴定的结果是一致的,预示着这两个突变位点对蛋白的结构稳定性较为重要。(3)采用荧光染料IAEDANS对突变体蛋白进行荧光标记,利用时间分辨荧光共振能量转移技术(TR FRET)技术对不同浓度GdnCl变性条件下1O6D突变体中色氨酸荧光寿命的变化进行检测。结果发现,5个1O6D突变体在变性过程中氨基酸之间距离的变化规律为:打结区域内部的突变位点如84及106位氨基酸与33位氨基酸残基之间的距离呈现逐渐减小的趋势;而打结区域外部的突变位点如68、120、127位氨基酸与33位氨基酸残基之间的距离呈现逐渐增大的趋势。由此可见,打结结构在变性过程中确实存在显著的构象变化,但对于打结结构详细的动态变化过程还需要进一步的实验或分子动力学模拟进行验证。