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酶促硅质壳-多肽复合水凝胶的制备及其在细胞培养中的应用

王政  
【摘要】:肽自组装水凝胶具有高含水量以及类细胞外基质的空间网状结构,因此在细胞培养、药物释放、生物支架材料和生物医学方面具有良好的应用,但其机械性能的不足限制了应用的发展,如何提升肽水凝胶的机械性能一直是科学界亟待解决的问题。酶催化反应具有高效性、特异性强且条件温和等优点,它是众多学者用于提升凝胶强度的一个重要手段。谷氨酰胺转氨酶(TGase)能够识别谷氨酰胺(Gln,Q)残基的γ-酰胺基和赖氨酸(Lys,K)残基的ε-氨基形成ε-(γ-谷酰胺)-赖氨酸的异肽键。硅藻是一类单细胞海洋生物,它最大的特点在于其具有高度硅质化且刚硬的细胞壁结构-硅质壳。硅质壳因其精细的微纳米孔及发散的肋带结构、优良的机械性能和高比表面积等特点而备受关注。在酶促反应的基础上,将硅质壳引入肽水凝胶体系中,充当一种骨架材料,起到进一步提升凝胶强度的作用。在本论文中,我们成功的从海洋硅藻细胞中提取得到硅质壳并设计合成得到I_4K_2(Ac-I_4K_2-NH_2)和Q3(Ac-Q_3GRGDS-COOH)两种多肽分子。在TGase催化作用下,将三者有效的结合并构建成酶促硅质壳-多肽复合水凝胶体系,主要研究内容如下:(1)我们以圆海链藻(Thalassiosira rotula)为培养对象,对其生长过程中细胞密度以及环境的pH进行分析实验,并通过SDS/EDTA和H_2O_2/HCl两种方法进行提纯。研究发现,6天后细胞密度趋于稳定,可进行细胞的收集;两种方法中后者的有机质去除率更高。上述研究表明,通过简便的提纯法就可以得到天然的生物二氧化硅材料。(2)我们在前期针对I_4K_2和Q3在TGase催化作用下形成水凝胶所开展工作的基础上,为了进一步增强其机械强度,使其更加稳定,将硅质壳引入酶促多肽水凝胶体系中。对该凝胶体系的形貌进行表征,并系统的从硅质壳引入量、孵育时间以及硅质壳的完整性三个方面考察对凝胶流变学性能的影响。研究发现,单独的凝胶体系储能模量G’约1600Pa,当硅质壳引入量为2.5mg/mL时,G’增加到约6KPa,提升了3-4倍。上述研究表明,在酶促反应的基础上,引入硅质壳可以作为一种提升多肽水凝胶机械强度的有力手段。(3)我们将制备得到的酶促复合水凝胶材料应用于细胞培养(MC-3T3-E1)和药物控释,分别对细胞的生长、迁移、诱导分化以及药物释放率进行了实验分析。研究结果发现,酶促复合水凝胶可以成为MC-3T3-E1良好的培养支架材料,并在诱导分化方面具有一定的优势,这是由于一方面Q3提供活性配体RGD(精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸)起到促进细胞粘附的作用;另一方面硅质壳的存在可以成为一种潜在的硅源,起到促进细胞分化的作用。在作为药物释放的凝胶体系中,硅质壳能够充当一种扩孔材料,提高了药物的最终释放率。


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