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新型DNA/纳米粒子生物功能化探针在DNA和细胞检测中的应用

钟华  
【摘要】:生物传感对于研究生物体内分子及细胞的结构和功能、生命活动的规律和本质、疾病的诊断、抗癌抗衰老等药物的设计、环境监测等都具有十分重要的意义。本文将DNA识别元件、适体识别元件与性能优良的纳米材料相结合,设计和研究了几种新型生物功能化探针,可用于癌细胞和靶DNA的特异性识别及检测。主要包括: 1.设计了一种细胞外超分子网状DNA/量子点(QD)鞘膜探针,可用于癌细胞的高亮度的荧光成像。该超分子网状DNA/QD鞘膜是由修饰了Ramos细胞适体的DNA纳米线作为骨架,层层自组装大量的DNA/CdTe QD探针构建而成。其中,DNA纳米线骨架上负载的Ramos细胞适体可以特异性识别Ramos细胞并缠绕到细胞表面,同时,DNA纳米线骨架与DNA/CdTe QD探针发生多层自组装,形成超分子网状DNA/CdTe QD鞘膜,将细胞牢牢包裹于其中。由于该超分子网状DNA/QD鞘膜携带大量的荧光量子点,具有极高的荧光强度,是一种的生物相容性良好的荧光成像材料。对构建的DNA纳米线和超分子网状DNA/QD鞘膜进行了结构表征,并将该材料用于Ramos细胞的荧光成像,获得了高荧光亮度的细胞成像图。该材料也成功的应用于混合细胞系中Ramos细胞的识别,进一步证明了它良好的选择性。 2.构建了一种新型的基于超分子网状DNA/CdTe QD鞘膜探针的电化学细胞传感器,可用于癌细胞的高灵敏高选择性定量检测。以Ramos细胞作为靶细胞,考察了方法的可行性。该电化学细胞传感器的构建原理为:将一端生物素修饰的Ramos适体固定到亲和素标记的聚苯乙烯微孔板上,由于适体对Ramos细胞具有很强的特异性识别能力,当加入细胞样品后,Ramos细胞被适体牢牢的固定在微孔板底部,再加入超分子网状DNA/CdTe QD鞘膜探针的合成原料,在细胞表面形成致密的超分子鞘膜探针。由于该超分子鞘膜是由DNA与CdTe QD发生多层自组装而成,负载了大量的CdTe QD标记物,具有显著的信号放大作用。将膜上的CdTe QD用稀酸溶解后得到Cd2+溶液,利用灵敏的差分脉冲阳极溶出伏安法(DPASV)对Cd2+进行定量检测。在优化的实验条件下,该电化学细胞生物传感器检测Ramos细胞的线性范围是10到1000个细胞,检测限为10个细胞。另外,该方法也成功的用于混合细胞系中Ramos胞的检测,证明该方法不仅灵敏度高,还具有良好的选择性,具有潜在的应用价值。 3.研制了一种新颖的信号放大型荧光探针,可用于癌细胞的高亮度荧光成像以及靶DNA的可视化检测。该探针以表面羧基化的聚苯乙烯微球为载体,共价结合DNA连接链,并以该连接链为起始端,自组装DNA纳米线/CdTe QD探针构建而成。由于DNA纳米线末端包含靶分子的识别序列,可特异性的与靶分子结合,确保探针的良好选择性;DNA纳米线中间部分含有大量的CdTe QD探针结合序列,可负载大量的荧光标记物,因此可产生显著的信号放大效应。本工作分别以细胞适体和靶DNA的互补序列为识别元件,构建了可用于癌细胞的高亮度荧光成像的功能化探针和靶DNA的可视化检测的探针。在癌细胞的荧光成像中,该探针表现出了良好的特异性和荧光成像能力;在DNA的可视化检测中,利用这种探针可以直接观测到50 fM的靶DNA杂交反应。 4.研制了一种新型一对一识别型三联金纳米粒子DNA探针,并构建了高灵敏的电化学DNA生物传感器。其工作原理为:在金电极表面固定巯基修饰的捕获DNA,之后分别与靶DNA和三联金纳米粒子DNA探针杂交,形成“三明治”式的DNA杂交复合物。探针上的三个金纳米粒子修饰了大量信号DNA,可以吸附大量的电化学指示剂[Ru(NH3)6]3+,利用计时电量法可实现靶DNA的电化学检测。该方法具有以下优点:一个三联金纳米粒子DNA探针只有一条靶DNA的识别链,因此可实现一对一的靶DNA识别和杂交,避免了传统DNA探针对靶DNA的消耗,提高了方法的灵敏度和选择性;三个金纳米粒子具有显著的信号放大效应,进一步提高了灵敏度。在优化的实验条件下,检测靶DNA的线性范围是1×10-16M~1×10-14 M,检测限为53 aM(3σ)。此外,对两碱基错配DNA以及非互补DNA检测结果表明,该方法具有良好的选择性。综上所述,该电化学DNA传感器灵敏度高,选择性好且操作简便,具有潜在的应用价值。


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