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《济南大学》 2012年
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谷胱甘肽的发酵生产及其分离纯化

刘超  
【摘要】:谷胱甘肽(L-Glutathione,GSH)是由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸经肽键缩合而成的具有多种重要生理功能的活性三肽。GSH具有清除自由基、延缓衰老、解毒和抗疲劳等多种生理功效,在临床上用于肝脏保护、治愈肿瘤和治疗内分泌紊乱等疾病。目前,谷胱甘肽生产方法有萃取法、化学合成法、发酵法和酶法,其中发酵法因其成本低、产量高、易分离、低污染等优点,己成为生产谷胱甘肽的主要方法。 本文以富含GSH的酿酒酵母LC-011为材料,以细胞密度和GSH的高产量、高产率为目标,采用一系列可行性方案来提高细胞密度和GSH的胞内含量,研究的主要内容及结果如下: 采用紫外诱变和NaNO_2交替复合诱变,通过ZnCl2和乙硫氨酸的抗性筛选,选育出了高产GSH菌株NU-08,将菌株NU-08和实验室保藏的假丝酵母SJ-209进行原生体制体融合,在0.5mol/L的蔗糖高渗缓冲液中酶解90min,NUD-08原生质体形成率为92.4%,再生率为8.9%,SJD-209原生质体形成率为88.5%,再生率为11.3%;通过融合和筛选最终得到一株融合子R-203,其GSH产量为328.71mg/L,比出发菌株分别提高了20.46%和55.9%。 对融合菌株R-203发酵培养基和发酵条件进行了优化,经过单因素试验、Box-Benhnken设计和响应面分析优化之后,确定发酵培养基中几个重要营养成分的百分含量分别是葡萄糖4.43%,酵母粉2.09%,谷氨酸浓度7.67mmol/L,甘氨酸浓度4.48mol/L, L-半胱氨酸浓度9.15mmol/L,最佳培养条件为温度30℃、装液量30mL/250mL、初始pH5.5、接种量5%、培养时间31h。通过优化,培养条件优化后GSH产量和生物量比优化前分别提高了108.96%和0.25%。 采用10L-微生物自动发酵罐与摇瓶相比发酵周期明显缩短,而且GSH产量也有所提高,在发酵罐中发酵24h谷胱甘肽产量达到最大为720.91mg/L与摇瓶发酵的最高产量(发酵时间56h)689.29mg/L相比提高了4.59%。补料发酵与分批发酵相比,虽然菌体R-203的发酵周期延长,但生物量、GSH产量以及胞内谷胱甘肽含量都有着明显的提高。流加补料培养基I和II生物量、GSH产量以及胞内谷胱甘肽含量与分批发酵相比分别提高了98.48%、161.41%、31.71%和107.71%、175.59%、32.69%。 研究表明,采用乙醇提取酵母中的还原型谷胱甘肽是简单有效的方法。此方法提取GSH损失少,蛋白质、色素、核酸等杂质溶出少,所得样品纯度较高,有益于后续的分离纯化,并且乙醇可回收利用,降低了成本。由实验结果可知,在40℃,pH1.0,乙醇浓度50%条件下提取40min,能有效地提取GSH,采用二次提取法验证其提取率达到95.4%。 强酸型离子交换树脂HD-8能够较好的分离与纯化谷胱甘肽,实验表明,在pH为2,上样速度1mL/min,用5%的盐酸控制洗脱速度0.5mL/min谷胱甘肽得到较好的分离纯化效果,其蛋白质去除率约64.71%,最高浓缩倍数为5.46,回收率达82.35%,具有良好的工业化前景。
【学位授予单位】:济南大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2012
【分类号】:TQ936.16

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【参考文献】
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