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《济南大学》 2017年
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基于pH指示剂显色效应的改进型酶联免疫检测方法研究

邵凤英  
【摘要】:传统酶联免疫吸附剂测定(ELISA)易受干扰,灵敏度低等一些缺点限制了其广泛应用。近些年对传统ELISA的改进已经做了许多努力,使其在生物传感检测中得到了很好的应用。纳米材料问世之后由于其一系列优点,如比表面积大,吸附能力强,催化效率高,生物相容性好等一直备受关注。非金属的纳米材料具有纳米材料的优点,不含有贵金属,绿色前驱体,成本低、无污染,因此受到更多的青睐。廉价的pH指示剂代替酶的使用,降低了实验成本,化学性质稳定,反应后颜色变化显著,实验结果可视化。本文中,利用非金属纳米材料作为信号载体,pH指示剂作为信号直接放大平台通过π-π共轭负载到纳米材料上,疾病标记物与纳米材料通过化学键牢固结合,在96-微孔板中构建成完整的免疫传感器。向微孔板的孔中加入定量的释放剂,释放剂与疏水性的指示剂分子反应,转化为亲水性的离子从纳米材料上释放到溶液中,引起溶液颜色发生变化。该方法实现了对疾病标记物的可视化超灵敏检测。具体检测内容如下:(1)设计了一种基于酚酞(PP)指示剂变色效应的改进传统ELISA,实现对癌胚抗原(CEA)的高灵敏可视化检测。类石墨烯氮化碳(g-C_3N_4)纳米材料由于具有较大的比表面积,容易制备,化学稳定性高,成本低,被羧基化后的g-C_3N_4(cC_3N_4)被用来作为该体系中信号分子的载体。免疫传感器制备成功后,加入碱性释放剂(AS),PP分子遇碱反应生成离子,释放到溶液中,引起溶液颜色发生变化。优化实验条件后,实现了对CEA的高灵敏可视化检测。检测范围是0.5 pg/mL到100 ng/mL,最低检测限(LOD)为0.34 pg/m L。这种方法是一种无酶的改进型ELISA,可以命名为PILISA。PILISA遵循酶联免疫吸附测定形式,同时避免了传统ELISA的缺点,为实际临床检测提供了一种很有发展前景的方法。(2)心血管疾病是引起全球死亡率高的主要原因之一,而心脏病标志物肌钙蛋白I(cTnI)和C-反应蛋白(CRP)的测定分别用于检测和诊断急性心肌梗死和冠状动脉综合症。使用聚多巴胺(PDA)包裹的g-C_3N_4(PDA-C_3N_4)作为信号载体,是由于PDA表面具有丰富的官能团,既可以与生物分子结合,又可以吸附大量的指示剂分子百里香酚酞(TP)和溴酚红(BR),设计的新型免疫传感器实现了对心脏病标记物cTnI和CRP的可视化双检测。灵敏度高,检测范围宽(cTnI:0.5 pg/m L-8 ng/mL;CRP:0.5 pg/m L-10 ng/m L),其中LOD分别为0.32 pg/m L和0.28 pg/mL。根据检测结果可以看出,该免疫传感器的稳定性、选择性和重现性都是令人满意的。(3)介孔二氧化硅(MSN)由于其特殊的孔状结构,比表面积大和易功能化等优点得到了广泛的应用。将MSN功能化,使其孔内带有芳香结构,能与疏水性的pH指示剂分子通过π-π共轭结合。MSN与聚乙烯亚胺(PEI)作用,使其表面显正电性,与表面带有负电的抗体分子作用连接。因此功能化的MSN作为信号载体参与构建免疫传感器,实现了对前列腺抗原(PSA)的可视化高灵敏检测。检测浓度范围宽(0.5 pg/m L-8 ng/m L),检测限低(0.21 pg/m L),并且该新型的免疫传感器具有良好的稳定性,选择性和重现性。此外,蛋白质生物标志物的比色检测由于其简单、快速、经济和稳定的信号输出特征在临床医学治疗中具有潜在的应用。
【学位授予单位】:济南大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:TP212.3

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