维持脱细胞角膜基质透明机理的研究

【摘要】：目的:探索维持脱细胞角膜基质透明的机理,研究一种新型的保护性脱细胞体系,在脱除异种细胞和抗原的同时,保持角膜结构和透明度,并初步观察新型脱细胞角膜基质的临床应用效果。方法:1.新鲜猪角膜刮除上皮后,采用飞秒激光将角膜切割成直径10 mm,厚度300μm或500μm的基质片。将500μm厚的猪角膜基质在超纯水中溶胀至1、2和5 mm厚,然后将其浸入100%甘油中进行脱水,透射电镜观察角膜基质纤维的超微结构变化,分析溶胀造成角膜透明度下降的原因。将500μm厚的猪角膜基质置于保护液中进行高静压处理(200 MP×1 min×2次),随后置于含有去垢剂和核酸酶的角膜脱细胞液体中,在26℃、100 rpm条件下处理2 h,为了探索胶体渗透压与离子渗透压在脱细胞过程中对角膜透明度维持的不同作用,在角膜保护液中加入不同剂量氯化钠,调节离子渗透压至200、400和600 mOsM,加入不同剂量试剂A,调节胶体渗透压至10、30和50 mmHg,检测不同离子和胶体渗透压对角膜透明度、厚度、透光率及脱细胞程度的影响,确定影响角膜透明度的关键因素。2.采用试剂A辅助的新型脱细胞体系制备脱细胞猪角膜基质(APCs),并对其生物学特征进行评价,包括透明度、厚度、体外透光率、DNA残留量、α-gal含量、胶原含量、糖胺聚糖(GAG)含量、机械性能等,通过扫描和透射电镜观察其超微结构。行MTT及迟发型超敏反应实验,观察其浸提液对人角膜上皮细胞增殖活性的影响及是否会引起豚鼠的迟发型超敏反应;行兔角膜基质囊袋移植、兔板层角膜移植术(300μm),观察术后角膜上皮愈合、透明度、新生血管及免疫排斥反应情况,评价其相容性。3.临床上对5例符合条件的角膜溃疡患者移植该新型脱细胞猪角膜基质,术后随访3个月,观察角膜上皮愈合速度、透明度、视力恢复、角膜厚度、缝线松动、眼压情况等,初步评价其临床效果。结果:1.与正常猪角膜基质相比,随着溶胀程度的增加,角膜透明度逐渐下降。虽然所有角膜通过甘油脱水后都恢复了透明,但溶胀超过2 mm厚度时,角膜基质纤维的完整性和规则排列被破坏且难以恢复正常。与补充氯化钠以达到各种离子渗透压相比,补充试剂A后胶体渗透压的增加对细胞脱除效率未产生明显影响,但是随着胶体渗透压的增高,脱细胞后角膜透明度、厚度和透光率均逐渐改善,当胶体渗透压达到50 mmHg时与正常猪角膜基质最为接近。2.使用胶体渗透压为50 mmHg的新型保护性脱细胞体系能够在2 h内完成脱细胞处理,同时保持角膜的结构和透明度。该体系去除了猪角膜基质中约98.6%的DNA成分和28.4%的α-gal成分,而胶原蛋白、糖胺聚糖含量和机械性能未见明显降低。新型脱细胞猪角膜基质浸提液对人角膜上皮细胞的增殖活性未产生明显影响,对豚鼠未引起明显的迟发型超敏反应;兔囊袋移植后6个月未见明显异常反应;兔板层角膜移植术后6个月,脱细胞猪角膜透明度良好,未观察到排斥反应,生物相容性好。3.5位患者进行新型脱细胞猪角膜板层移植后,平均3.8±1.5天可完成角膜再上皮化。3个月时,患者的平均裸眼视力为0.25±0.09,平均最佳矫正视力为0.42±0.16,较术前明显改善;角膜厚度为504.2±54.2μm,植片厚度为411.0±31.8μm,未见层间渗出;眼压为9.4±3.4 mmHg;角膜植片透明,未发生明显的免疫排斥反应。结论:角膜过度肿胀会引起基质纤维超微结构不可逆的损伤,并导致透明度下降,通过胶体渗透压控制角膜的溶胀程度是维持脱细胞角膜基质透明度的关键因素;胶体渗透压辅助的新型脱细胞体系在有效脱除猪角膜基质细胞和抗原的同时,未对角膜超微结构、胶原和糖蛋白成分造成明显破坏;新型脱细胞猪角膜基质具有免疫原性低、生物力学和生物相容性好等特点;临床移植3个月时,患者角膜透明、视力恢复良好、眼压稳定、未见层间渗出及免疫排斥反应。

【学位授予单位】：济南大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R772.2