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DNA-纳米羟基磷灰石修饰电极的制备及在生物分析中的应用

张诺  
【摘要】: DNA是活细胞中最重要的分子,它含有特定细胞的全部遗传信息,在分子生物学和生物医学领域的研究非常广泛。DNA生物传感器是当今生物传感技术的研究热点。用DNA修饰电极研究DNA与其他物质的相互作用,不仅能克服溶液电化学方法背景信号大,弱信号难以提取的缺点,而且DNA的用量大为减少,方法的灵敏度得到提高,以较少样品消耗得到多种作用参数。研究DNA与其它小分子的相互作用是生物化学和分子生物学中的重大课题,对疾病诊断、环境检测、医药研究和新药设计起着重要作用。水溶性阳离子卟啉具有优异的生物活性,可以作为潜在的抗癌、抗菌药物和核酸结构及动力学探针,其与DNA的相互作用成为研究的热门话题。对卟啉化合物与DNA结合模式的研究也有助于寻求卟啉化合物的生物活性及其与DNA的结合模式之间的关系。DNA与药物分子等相互作用的研究,有助于人们了解某些药物分子对DNA体内复制和转录的影响以及由此引起的物种性变异、各种化合物与DNA间亲和力的大小和化学核酸酶的作用机制等信息。 本文合成了具有优良生物相容性和独特吸附性的羟基磷灰石(HAp),并制备了DNA-纳米羟基磷灰石修饰电极(dsDNA/HAp/GCE),用表面电化学法研究了DNA与其它小分子的相互作用。论文主要包括以下几个方面的内容: 第一部分概述了DNA修饰电极制备方法的研究现状及DNA修饰电极的研究意义和应用。介绍了本论文的研究内容及特点。 第二部分介绍了HAp的制备及表征。HAp [Ca10(PO4)6(OH)2]是常用的骨修复材料,其规则的立体化学结构和独特的多吸附位点使其在催化、蛋白质分离等领域倍受瞩目。本文采用共沉淀法与微乳液法方法,制备了纳米HAp,并分析了在微乳液介质中HAp的合成过程。 第三部分研究了DNA与水溶性阳离子卟啉-三甲铵基苯基卟啉(TAPP)的相互作用及检测DNA损伤。利用滴涂法将具有优良生物相容性和独特吸附性的HAp修饰在玻碳电极上形成纳米薄膜。电化学实验结果证明该纳米HAp薄膜能有效地将双链DNA吸附于其表面。采用循环伏安法和交流阻抗法系统研究了固定在HAp薄膜上的DNA与TAPP之间的相互作用并将此修饰电极用于检测DNA损伤和测定卟啉类物质。实验结果表明,在50 ~ 250 mV·s-1扫描速度范围内该电极反应过程系表面吸附反应控制;在pH值为3.7 ~ 9.1的区间内,随pH值增大,TAPP的氧化还原峰都发生正移,这表明TAPP在DNA修饰电极上的氧化还原过程不仅有电子参与,而且还有质子参与;在pH = 7.0的磷酸盐缓冲溶液(PBS)中,随溶液离子强度增大,TAPP在DNA修饰电极上的表观式量电位不断正移,表明TAPP与DNA之间的相互作用主要是小沟槽的嵌入作用,二者可生成超分子化合物。根据Langmuir吸附公式,得出TAPP与DNA之间的结合常数为1.48×105 mol·L-1。 第四部分研究了维生素B12与DNA的相互作用。采用循环伏安法系统研究了维生素B12与DNA在pH = 4.9的HAc-NaAc中相互作用的电化学行为,所得结论比溶液电化学法更具说服力。实验结果表明,DNA的存在能导致维生素B12还原峰电流的降低。通过测定裸玻碳电极和DNA修饰电极的一些电化学参数,证明维生素B12与DNA在该实验条件下结合生成了一种非电活性的超分子化合物,并利用一系列方程求得该超分子化合物的组成为1 : 1,结合常数β= 5.35×105 mol·L-1。 第五部分研究了DNA修饰电极对氯霉素的电催化作用。利用dsDNA/HAp/GCE对氯霉素的电催化作用,建立了对氯霉素含量进行定量分析的一种电分析方法。在pH = 6.0的KH2PO4-Na2HPO4缓冲溶液和0.1 mol·L-1 KCl溶液中,氯霉素的浓度在2.80×10-7 ~ 3.60×10-6 mol·L-1范围内与峰电流呈良好的线性关系,线性回归方程和线性相关系数分别为:ip(μA) = 5.865 + 0.4784 c (μmol·L-1),r = 0.9942,检测限可达1.35×10-7 mol·L-1。利用该法对氯霉素滴眼液进行定量分析,8次平行样品分析结果的相对标准偏差小于3 %,完全满足定量分析的要求。


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