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《山东轻工业学院》 2011年
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白腐菌漆酶的制备、催化聚合的研究及漆酶基因克隆的初探

季万镇  
【摘要】:漆酶(EC1.1.0.32,对苯二酚:氧氧化还原酶)是一种含多个铜原子的多酚氧化酶,具有较高的氧化还原电位,能催化氧化多种芳香类化合物,在环境保护、制浆造纸、食品加工、有机合成等领域具有广阔的应用前景。本研究以漆酶的高效生产为目标,对漆酶高效产生菌株Trametes hirsuta BYBF进行了扩大培养、漆酶的分离纯化及酶学性质、漆酶在氯酚类废水中的应用等方面进行了较为系统的研究和分析,并对此漆酶基因的克隆进行了初探。 气升式生物反应器的结构简单、反应启动快、氧传质效率高、剪切力小,利用菌丝球在流化床内产漆酶,可以使菌丝球、发酵液和氧气得到充分接触,能大大加快白腐菌产漆酶的进程。本实验室拟采用自己设计的2.5L三相流化床生物反应器进行产酶研究,实验结果表明:在通气量是3.0L/min,接种量是10%的条件下,发酵五天后酶活即可达到3.36IU/mL,与摇瓶发酵相比(1.58IU/mL),不仅缩短了产酶周期,而且酶活也得到了大幅度的提高,大大提高了产酶效率和产酶量。利用流化床生物反应器还可对菌丝球进行重复分批发酵,实验表明Trametes hirsuta BYBF菌丝球至少可以重复发酵五次,漆酶产率均在0.5 IU/( mL·d)以上。该工艺不仅节省了液体菌种的培养时间和消耗,而且减少了生产成本,提高了生产效率,为漆酶的工业化生产奠定了基础。 通过离心、过滤收集白腐菌Trametes hirsuta BYBF的发酵液即得粗酶液,然后通过硫酸铵沉淀、透析浓缩、DEAE-Sepharose阴离子层析柱和Sephadex G-100分子筛层析对所得粗漆酶进行了分离纯化,得率是8.9%,纯化倍数是10.2,纯化后得到的漆酶经SDS-PAGE检测证实为单一蛋白,并与标准蛋白比较得到此漆酶的表观分子量为33.9KDa。以ABTS为底物时,酶的最适反应温度和pH分别是55℃和4.5。此酶具有较好的温度和pH稳定性,基本能够满足工业生产对酶的要求。 此外,还以愈创木酚和ABTS为底物对漆酶的反应动力性进行了研究,以愈创木酚为底物时,Km和Vmax分别是1.32 mmol/L和4.5×10~(-6) mol/L﹒min,以ABTS为底物时,Km和Vmax分别是0.032mmol/L和8.7×10~(-6) mol/L﹒min,所以漆酶对ABTS具有较大的反应活性。在最佳的反应条件下,我们研究了浓度为2mmol/L无机元素对酶活性的影响:Fe~(3+)、Ag~+、Mn~(2+)对酶活性具有抑制作用,Mg~(2+)、Cl~-、Na~+、Ca~(2+)对酶活影响不大,而Cu~(2+)、Al~(3+)、Zn~(2+)能明显提高漆酶的活性,其中Cu~(2+)对提高漆酶活性提高幅度最大。 制浆造纸工业中氯漂废水中含有大量的氯代酚及其衍生物,这类有毒物质排放到环境中严重威胁着生态平衡。本研究以2,4-二氯苯酚(简称2,4-DCP)为氯酚类化合物的模型物,在曝气的条件下,研究白腐菌Trametes hirsuta BYBF产漆酶对2,4-DCP的去除效果:研究发现2,4-DCP的去除率随反应时间的延长而增大,在适宜的条件下,当底物浓度为10mM/L时,曝气20h后去除率就可以达到93.6%。此外,2,4-DCP的去除效果也受到反应体系的温度、pH值等因素的影响,在温度和pH是25℃-45℃和pH4-6范围内是具有较好的去除效果。在最适条件下曝气20h,纯化漆酶和粗漆酶液对2,4-DCP的去除率分别为84.9%和93.6%,这就说明纯化漆酶要比粗酶液处理酚类物质的效果要差一些。 最佳条件下,在漆酶的作用下曝气10h,经蛋白酶和水洗处理后,测得聚合物的分子量为2838(二氯代酚的分子量为163),可见漆酶对2,4-DCP有很好的催化聚合作用。用红外和13C-NMR对处理后的聚合产物的结构进行了分析,产物是带有酚羟基的高分子聚合产物,并且聚合产物上的苯环在漆酶的作用下会发生开环反应产生带羧基的脂肪族侧链。推测其催化聚合反应机理可能是首先生成酚氧游离基,游离基之间相互结合生成二聚体或三聚体,然后发生电子转移,进一步脱氯生成相对稳定的低分子聚合物,低分子聚合物之间也能发生脱氯聚合生成高聚物,最后高分子聚合物中部分苯环会发生开环反应,生成羧酸类物质。此外,底物之间还能发生交叉偶联,生成复杂的交联产物,这样就可以使有毒的酚生成疏水性高聚物通过沉淀而除去。 此外,还成功地用CTAB法提取了此白腐菌的DNA,提取RNA并经琼脂糖凝胶电泳检测,电泳图谱表明分离得到了高纯度的DNA和RNA,满足了分子生物学对基因片段的要求,根据实验要求,设计并合成了漆酶基因的简并引物,通过RT-PCR的方法成功扩增了漆酶的基因,并分析确定克隆得到的漆酶基因,将目的基因与载体pMD 19-T连接并转化到大肠杆菌上,通过蓝白斑实验确定阳性克隆,回收目的片段并进行测序,得到一段长度为2154bp的核苷酸序列。利用ClastalW软件对克隆得到的漆酶基因片段进行同源性比较,发现在核苷酸酸序列与血红密孔菌、栋迷孔菌、环带干酪菌与朱红密孔菌同源性均较高同源性分别为98%、99%、99%,而北方梭囊孔菌、单色下皮黑孔菌同源性较低,分别为59%、43%。
【学位授予单位】:山东轻工业学院
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2011
【分类号】:X703

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