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《山东轻工业学院》 2012年
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产普鲁兰酶菌株Bacillus cereus OPF0031的筛选鉴定及功能基因的克隆

董桂秀  
【摘要】:海洋沉积物中含有一定量的微生物,其中许多菌株能够分泌普鲁兰酶,这为普鲁兰酶及其产生菌的研究提供了另一个发展方向。本文从海洋沉积物中的筛选出几十株产普鲁兰酶的菌株,并随机选取了其中一株对其进行了相关的研究探索。 本文通过改变培养基的营养成分、培养温度、pH值等条件来筛选产普鲁兰酶的菌株,产酶菌株通过观察透明圈的生成来进行初筛。将透明圈中心的菌落用接种针转接到发酵培养基中进行发酵。实验中的复筛通过测定普鲁兰酶活力(以DNS法测定酶促反应中产生的还原糖的量表示)确定。实验经过初筛与复筛共选出40株具有普鲁兰酶活性的菌株,其中有九株的产酶能力相对较高,其编号分别为OPF0031、P14、Y15、A36、A39、P51、P13、Y17、A33、Y11、Y12、P12、A35。 本文利用菌种的16S rDNA序列特点和生理生化特点进行菌株OPF0031的鉴定,实验结果表明OPF0031的16S rDNA序列与菌株Bacillus cereus strain Cr-50的16SrDNA序列相似度高达99%,并且该菌具有的生理生化特点也与典型蜡状芽胞杆菌的特点基本一致,因此本文将OPF0031归为蜡样芽胞杆菌,并将该菌命名为Bacilluscereus OPF0031,其16S rDNA序列上传到GenBank数据库,获得序列号为JQ824137。 为进一步的提高菌株Bacillus cereus OPF0031的产酶能力,通过单因素优化实验和响应面实验对该菌的初始培养基进行了优化。碳源优化实验结果表明,葡萄糖最有利于普鲁兰酶的生产,其次是相对分子量比较小的糊精,可溶性淀粉、马铃薯淀粉、糯米淀粉等对普鲁兰酶的分泌影响相对较小;氮源优化实验中发现牛肉膏与蛋白胨对普鲁兰酶的产量的影响要远远高于其他几种氮源,并且随着氮源的添加量增大,普鲁兰酶产量也得到提高,实验还发现酵母粉、复合氨基酸、黄豆饼粉和棉籽饼粉对普鲁兰酶的分泌影响不大。从离子优化的结果中发现,K+、Al3+、 NH4+和Mg2+对产酶量的影响力较大。利用响应面实验分析得出产普鲁兰酶的最佳发酵培养基,其组成为:糯米面15g/L,硫酸铵9g/L,硫酸镁0.9g/L,硫酸铁0.018g/L,蛋白胨10g/L,磷酸二氢钾0.5g/L培养温度为30℃,转速为180r/min。在此最佳条件下,实际测得的普鲁兰酶的活力为1.3871U/mL,比优化前的产酶量提高了近14倍。 通过GenBank下载并比对相关普鲁兰酶(由芽胞杆菌属菌种所产)的序列。经DNAMAN比对发现,所有相关序列的主要分为两类,并且其3′端与5′端都具有高度保守的序列,根据此保守序列进行引物设计。并以Bacillus cerues OPF0031基因组为模板成功克隆出编码普鲁兰酶的基因,上传到GenBank数据库获得序列号JQ707952。
【学位授予单位】:山东轻工业学院
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2012
【分类号】:TQ925

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