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《齐鲁工业大学》 2017年
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新型高甜度及强热稳定性甜味蛋白monellin突变体的分子构建

蔡成固  
【摘要】:甜味蛋白monellin是一种高甜度,低热量的甜味物质,由于本身不含糖分,未来有望成为糖尿病和龋齿病患者的甜味替代品。但是由于其生产成本高、热稳定性低等原因限制了其大规模工业化生产的进程。本研究针对如何提高甜味蛋白monellin甜度及热稳定性进行了研究。将前期工作中构建成功的pET15b-MNEI重组质粒导入到大肠杆菌BL21-CodonPlus(DE3)-R-IL中进行蛋白表达,经过镍离子柱亲和层析纯化和分子筛层析纯化后获得了纯度较高的目的蛋白。随后,采用人工品尝双盲评审法测定野生型monellin蛋白的甜味阈值为1.1μg/ml;熔点温度确定采用圆二色谱仪测定蛋白在升温过程中的圆二色光谱变化,经过分析计算得到野生型monellin蛋白的熔点温度(T_m)值为74.2℃。为了提高monellin蛋白的甜度和热稳定性,我们分析了单链monellin蛋白的三维结构,从影响甜度和稳定性的因素出发,通过改变蛋白表面电荷、蛋白内部疏水性作用、范德华力等分子间作用力对monellin蛋白设计了一系列突变位点。通过对突变体蛋白理化性质测定得到了E2N、E23A、Y65R三个优良突变体蛋白,同时发现了六个双突变可以导致monellin蛋白集聚,丧失活性。为了得到性质更加优良的突变体蛋白,我们将E2N、E23A、Y65R三个突变体蛋白排列组合后,最终得到了一个甜度和热稳定性均明显提高的双突变蛋白E2N/E23A,该突变体蛋白的甜味阈值降至0.38μg/ml,熔点温度提升至84.9℃。通过对突变体蛋白分析,我们发现甜味蛋白质内部带电荷氨基酸的离子化状态是影响其热稳定性的关键因素,而蛋白质表面带电荷氨基酸对其甜味具有重要影响。本研究通过定点突变方法提高了monellin蛋白的甜度和热稳定性,得到的突变体蛋白E2N/E23A有望应用于monellin蛋白的大规模工业化生产。此外,发现了蛋白内部一些维持结构骨架的重要氨基酸位点,为此后研究该蛋白的稳定性与集聚性质奠定了基础。
【学位授予单位】:齐鲁工业大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:Q51

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