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《齐鲁工业大学》 2017年
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兽疫链球菌发酵生产透明质酸的工艺研究

牛全凤  
【摘要】:透明质酸(Hyaluronic acid,HA)是通过β-1,3和β-1,4糖苷键,反复交替连接β-D-N-乙酰氨基葡萄糖与β-D-葡萄糖醛酸两种单糖而形成的高分子粘多糖。由于HA独特的理化性质与生理功能,被广泛应用于化妆品、保健品和医学等领域。目前,我国HA市场供不应求,发酵法生产HA具有不受原料资源限制、生产成本低、环境友好、操作简便、便于大规模生产等优点。但发酵法生产HA仍存在技术难题。因此研究发酵法生产HA工艺十分必要,尤其是HA的下游提取工艺与降解研究是发酵法应用于实际工业化生产中的关键。本文以兽疫链球菌NQ185为生产菌株,对HA的发酵、提取及降解工艺进行了研究,主要研究内容和结论如下:(1)利用单因素与正交实验,研究培养基组分对HA代谢积累的影响,确定最优培养基组分为:葡萄糖80 g/L、酵母粉14 g/L、蛋白胨10 g/L、酵母蛋白胨8 g/L、MgSO_41.2 g/L。重复实验验证,按照优化后的培养基组分条件,摇瓶发酵得到HA产量为0.91 g/L,与优化前相比提高了28.17%。(2)采用5 L自控发酵罐进行HA发酵控制参数优化及放大实验,通过单因素实验确定了最优培养条件为:pH值7、接种量10%、温度37℃、搅拌转速300r/min、通气量2 L/min。结合前期优化的培养基组分条件,利用5 L自控发酵罐,发酵周期16 h,得到HA的产量为8.54 g/L,平均分子量为2.55×10~6 Da。(3)对HA预处理、酶解法及硅藻土后处理技术进行了研究,最终确定了HA最佳提取路线:发酵液中添加氯化钠使其浓度为0.4 mol/L,加入2倍体积的95%乙醇进行沉淀,离心后将沉淀复溶于与发酵液等体积的蒸馏水中。利用三氯乙酸调节溶液pH值至4.5,静置1 h后用氢氧化钠回调pH值至7.0。选用胰蛋白酶在pH值8.4,酶解温度50℃,酶用量0.174 g/g条件下酶解6 h。利用95%乙醇将溶液稀释1倍后使用1 cm厚度的硅藻土预敷层进行真空抽滤。最后再经过乙醇沉淀,采用真空冷冻干燥得到HA成品:HA得率83.86%、葡萄糖醛酸含量43.28%、蛋白质含量0.21%、蛋白去除率98.95%、分子量2.15×10~6 Da。(4)通过对HA热降解、超声降解和氧化降解方法的研究与比较,确定采用超声-氧化联合降解的方法:HA溶液中添加2 mmoL/gHA的抗坏血酸,用盐酸溶液调节pH值至4,再加入4 mmoL/gHA的过氧化氢后,利用超声破碎仪进行200 w超声降解20 min。降解得到了低分子量HA,分子量为12.16 kDa。
【学位授予单位】:齐鲁工业大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:TQ920.6

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