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《齐鲁工业大学》 2017年
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藜麦皂苷对口腔致病菌的抑制作用及其机理研究

孙晓燕  
【摘要】:藜麦是安第斯山脉主要的粮食作物,因其优良的营养价值在全世界范围内推广种植。藜麦在加工成藜麦米的过程中会产生约20%-35%的麸皮,这些麸皮通常会被丢弃而造成资源的浪费,而麸皮中通常含有约3%-8%的藜麦皂苷。据报道藜麦皂苷具有抗炎和抗真菌的效果,但是藜麦皂苷对口臭相关的微生物的抑制作用仍不清楚。本课题的主要拟先对藜麦麸皮皂苷进行分离、纯化以及碱处理等,然后测定其对口腔致病菌包括牙龈卟啉单胞菌、产气荚膜杆菌和具核梭状杆菌的抑制作用及其作用机理,为藜麦皂苷作为治疗口臭产品的添加剂提供理论基础。将分离、纯化以及碱处理等过程后的皂苷,通过采用滤纸片法和微量二倍连续梯度稀释法来评价皂的抑菌活性。测定的样品包括藜麦粗皂苷(QS)、碱处理的粗皂苷(ATS)、30%乙醇洗脱皂苷(QS-30)、碱处理以后30%乙醇洗脱皂苷(ATS-30)、80%乙醇洗脱皂苷(QS-80)、碱处理以后80%乙醇洗脱皂苷(ATS-80),结果表明:ATS-80组分对牙龈卟啉单胞菌、产气荚膜杆菌和具核梭状杆菌的抑制活性最高:牙龈卟啉单胞菌为62.5μg/mL(MIC)和250μg/mL(MBC);产气荚膜杆菌为31.3μg/mL(MIC)和250μg/mL(MIC);具核梭状杆菌为31.3μg/mL(MIC)和125μg/mL(MBC)。利用高效液相色谱仪(HPLC)以及液质联用高分辨质谱仪(LC/ESI-MS/MS)对ATS-80进行鉴定,结果表明:藜麦皂苷经过80%乙醇洗脱的到的组分QS-80在碱处理前后皂苷单体以及各单体含量之间有很大的变化,峰1,2,3和4在碱处理以后80%乙醇溶液洗脱得到的ATS-80中没有检出。QS-80组分中的高极性皂苷含量高于ATS-80为284.5mg/g,而ATS-80组分中低极性皂苷的含量高于QS-80为341.87mg/g。这种碱处理以后皂苷单体极性的变化在抑制微生物活性中起到了关键作用。通过测定细菌细胞膜的完整性、细胞膜的膜电势变化、生物被膜的抑制率、生物被膜活性以及细菌形态的变化五个方面来探究碱处理以后的藜麦皂苷对口腔致病菌的抑制作用的机理。结果表明:ATS-80能够造成培养液中核酸以及蛋白质含量的增加。在ATS-80处理32h以后,其中0-24h之间培养液中核酸和蛋白质的含量在稳定增加,之后趋于稳定状态。三种口腔致病菌中具核梭状杆菌对ATS-80最为敏感。具核梭状杆菌在ATS-80不同浓度条件下与空白对照组相比,核酸和蛋白质增长的倍数分别为:核酸在MIC下为4.30,MBC下为6.19;蛋白质在MIC下为12.22,MBC下为21.36。同时,ATS-80能够显著降低细菌细胞膜的膜电势。牙龈卟啉单胞菌、产气荚膜杆菌以及具核梭状杆菌三种口腔致病菌在不同浓度的ATS-80条件处理下的细胞膜电势的变化为:牙龈卟啉单胞菌为48.40%(MIC)和75.07%(MBC),产气荚膜杆菌为58.44%(MIC)和80.13%(MBC),具核梭状杆菌为54.33%(MIC)和80.38%(MBC)。不同浓度的ATS-80对具核梭状杆菌生物膜的抑制率有很大影响。在MIC浓度下是生物被膜的抑制率为38.56%,浓度为MBC时生物被膜的抑制率为89.73%。ATS-80在不同浓度条件下对具核梭状杆菌生物被膜的活性有很大影响。空白对照组的生物被膜活性为70.435%,最小抑菌浓度(MIC)处理下的生物被膜的活性为40.231%,最小杀菌浓度(MBC)处理下的生物被膜的活性为10.569%。透镜电子显微镜下观察具核梭状杆菌在不同浓度的ATS-80处理下的细菌形态发现:正常的具核梭状杆菌的细菌形态具有完整的细胞结构,细胞壁以及细胞膜完整,内容物均匀分布;经过最小抑菌浓度(MIC)处理的具核梭状杆菌,细胞壁破裂,细胞内容物在细胞膜周围聚集和凝结;经过最小杀菌浓度(MBC)处理的具核梭状杆菌,不具备完整的细菌形态,细胞壁以及细胞膜破裂,内容物溶出到细菌培养液中。直接反映了碱处理藜麦皂苷组分ATS-80的抑菌机理。综上所述,结合藜麦皂苷的抑菌活性,碱处理以后的80%乙醇洗脱皂苷(ATS-80)可以用于抗菌剂治疗口臭。
【学位授予单位】:齐鲁工业大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:R151;TQ464.3

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