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《齐鲁工业大学》 2017年
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响应氨基葡萄糖的glmS核酶生物传感器的构建及应用

郝李振  
【摘要】:氨基葡萄糖(GlcN)是人体关节软骨基质中合成蛋白聚糖所必需的重要成分。它对于人体及动物体的关节健康和身体的免疫调节具有重要的作用。目前商品化的GlcN全部是来自虾、蟹等甲壳原料的高温水解,生产过程能耗大,污染严重,因此,有必要从根本上改变GlcN的生产方法。利用微生物发酵法直接合成GlcN是理想的策略,在此前报道中已有利用微生物发酵直接合成GlcN的先例,但其无法解决在发酵过程种实时检测GlcN变化的问题。glmS核糖开关是至今发现的唯一能够调控糖代谢的核糖开关,只存在于革兰氏阳性菌中,位于编码氨基葡萄糖合酶的mRNA的5'UTR内,它需要小分子物质GlcN-6P才能激活,这在已经发现的核酶中是非常少见的,目前对glmS核糖开关的相关研究较少。本文的主要内容为:利用glmS核糖开关与增强型绿色荧光蛋白构建生物传感器,并在枯草芽孢杆菌中验证其功能。本文首次将酿酒酵母的氨基葡萄糖合酶基因(gfa1)和枯草芽孢杆菌的氨基葡萄糖合酶基因(glms)分别与氨基葡萄糖乙酰化酶基因(gna1)连接,再与glms生物传感器相连接,(1)gfa1-gna1-生物传感器利用枯草芽孢杆菌表达载体PHT01质粒,转化到安全菌株枯草芽孢杆菌WB800N中;(2)glms-gna1-生物传感器分别通过表达载体PHT01质粒,转化到安全菌株枯草芽孢杆菌WB800N中;(3)glms-gna1-生物传感器直接整合到枯草芽孢杆菌WB800N中。通过比对荧光强度和GlcN含量,确定荧光强度和GlcN含量的关系。并通过荧光强度和GlcN的对比,筛选出高产GlcN的菌株。研究结果表明,实现gfa1与gna1组合和glms与gna1组合两种组合通过穿梭质粒和整合基因组两种不同方式在枯草芽孢杆菌表达体系里的表达,以上基因的表达,成功提高胞内GlcN及GlcNAc的含量。并通过分析GlcN含量与荧光表达的关系,最终得出整合型工程菌WB800N-glms-gna1-Ribo-egfp最终发酵结果最好,最终产量达到20.4g/L,是原始菌GlcN产量的4倍。
【学位授予单位】:齐鲁工业大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:TQ929;TP212.3

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1 郝李振;响应氨基葡萄糖的glmS核酶生物传感器的构建及应用[D];齐鲁工业大学;2017年
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