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《齐鲁工业大学》 2017年
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基于金属离子的槐糖脂合成过程中关键酶的初步研究

刘跃文  
【摘要】:槐糖脂(Sophorolipids,SLs)是一种由非致病性酵母发酵产生的一种胞外多糖类生物表面活性剂。目前已知产槐糖脂的菌株有很多,但由它们发酵合成槐糖脂的产量和组成不一。造成产量和类型不同的原因之一是槐糖脂的发酵底物不同。不同类型的槐糖脂作用不同,对槐糖脂进行适当修饰,可以得到生活、生产中更加需要的槐糖脂类型。金属离子也是影响槐糖脂合成的因素之一,但很少有关于金属离子与槐糖脂关系的文章。金属离子是细胞生长的必需元素,酶活性的发挥离不开金属离子的参与。金属离子对槐糖脂的影响很可能是金属离子影响了某种酶的活性。这些酶包括细胞色素P450(cytochromeP450,CYP450)、葡萄糖基转移酶(Glucoxytransferase,UGTB)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GPD)、乙酰基转移酶、内酯化酶。合成槐糖脂的第一步是将疏水性碳源末端或近末端羟基化,这一步的完成需要细胞色素P450的催化作用,细胞色素氧化酶活性的发挥需要Fe~(2+),推测金属离子、细胞色素P450、槐糖脂三者之间可能存在某种联系。本文首先探究了Mg~(2+)、Cu~(2+)、Fe~(2+)在不同添加时间条件下对槐糖脂的影响;然后建立测定槐糖脂合成过程中P450酶活的方法,并且通过HPLC初步探究底物消耗法测定P450酶活的可行性;最后研究细胞色素P450在不同金属离子条件下及不同添加时间下的酶活和槐糖脂的产量,验证底物消耗法测定P450酶活方法的可行性。通过三方面的实验得出金属离子、细胞色素P450、槐糖脂三者之间的关系。为获得槐糖脂的最大产量和定向合成不同类型的槐糖脂奠定了基础,为槐糖脂在今后大规模应用提供了参考依据。本文主要的研究内容和结果如下:1.金属离子对槐糖脂的影响。本文选取Mg~(2+)、Cu~(2+)、Fe~(2+)三种金属离子作为研究对象。Mg~(2+)、Cu~(2+)、Fe~(2+)三种金属离子的添加时间分别为0 h、4 h、8 h、12 h、16 h,每隔四个小时添加金属离子,待发酵7天后对发酵液中的各种指标进行检测。实验结果显示在金属离子添加时间0 h、4 h、8 h、12 h、16 h下,细胞干重呈先增加后减少的趋势。不同金属离子、金属离子的不同添加时间都会对槐糖脂产生影响。对总槐糖脂产量来说,添加Mg~(2+)时获得槐糖脂的最大产量为90 g/L左右,这是菌种发酵4-12 h后添加镁离子获得的;Cu~(2+)在添加时间为4 h获得最大产量,产量为81.38 g/L;Fe~(2+)在4 h获得最大产量52.03 g/L。总槐糖脂产量总体趋势先增加后减少。对内酯型槐糖脂(Lactone-Sophorolipids,L-SLs)产量来说,添加Mg~(2+)、Cu~(2+)、Fe~(2+)都在4 h获得最大产量,分别为54.84 g/L、37.57 g/L、26.23 g/L。三种金属离子内酯型槐糖脂产量的总体趋势都是先增加后减少。就酸型槐糖脂(Acid-Sophorolipids,A-SLs)产量来说,添加Mg~(2+)在12 h获得最大产量,产量为56.23 g/L。添加Cu~(2+)在0 h获得最大产量,产量为49.50 g/L。酸型槐糖产量在0-16 h时间范围内呈下降趋势;添加Fe~(2+)在0 h获得最大产量31.97 g/L。0-16 h,产量呈下降趋势。从得到槐糖脂类型的比例来看,在菌种开始发酵4 h后添加Mg~(2+),得到内酯型槐糖脂的比例高于酸型槐糖脂;从发酵一开始(0 h)添加Cu~(2+),得到的酸型槐糖脂的比例高于内酯型;从发酵一开始(0 h)添加Fe~(2+)生成的酸型槐糖脂比例更高;在16 h添加Fe~(2+)有利于内酯型槐糖脂的产生。可以根据金属离子的最适添加时间得到更多想要的槐糖脂类型,对于定向合成不同类型的槐糖脂具有重要意义。2.细胞色素P450酶活方法的建立。本文首先用油酸标准品绘制油酸标准曲线,实验设置5个不同的浓度,每个浓度设置3组平行。然后用HPLC测定了发酵液中油酸的含量,得出油酸的消耗速率。最后提取拟威克酵母发酵72 h后的微球蛋白,构建细胞色素P450酶活分析体系,利用高效液相探究Mg~(2+)、Cu~(2+)、Fe~(2+)对细胞色素P450的酶活的影响。实验结果显示发酵72 h后发酵液中油酸的消耗速率由快到慢依次为Mg~(2+)、Cu~(2+)、Fe~(2+),它们的消耗速率分别为9.55 x10~(-3)μmol/min、8.84 x10~(-3)μmol/min、1.13x10~(-3)μmol/min;添加Mg~(2+)、Cu~(2+)、Fe~(2+)发酵72 h后P450的活性分别为5.37 U、5.34 U、5.24 U,空白对照组CYP450的酶活为5.08 U。从实验结果可以看出金属离子影响了CYP450的酶活。通过本章实验,建立了一个测定细胞色素P450酶活的方法。并证明了利用油酸消耗速率测定CYP450酶活的方法基本可行。3.槐糖脂合成过程中细胞色素P450的酶活分析。验证细胞色素P450酶活测定方法基本可行后,分别对4 h、8 h、12 h、16 h金属离子添加时间下的P450酶活进行测定。实验结果显示,从0 h到16 h,随着金属离子添加时间的延迟,细胞色素P450的酶活先增加后减少。在8 h左右添加Mg~(2+),细胞色素P450的酶活最高,为5.54 U;添加Cu~(2+)在4 h左右,细胞色素P450的酶活最高,为5.33 U;添加Fe~(2+)在4 h左右,细胞色素P450的酶活最高,为5.32 U。不同时间添加Mg~(2+)、Cu~(2+)、Fe~(2+)得到的酶活与前面的实验中槐糖脂产量先增加后减少的现象对应。在金属离子及其添加时间的影响下,细胞色素P450的酶活受到金属离子和金属离子添加时间的影响,与空白对照比较,CYP450的活性受到的影响较大。根据本文探究得到金属离子及金属离子添加时间影响了P450的酶活,进而影响了槐糖脂的产量和组成的初步结论。
【学位授予单位】:齐鲁工业大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:TQ920.6;TQ423;Q55

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