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《齐鲁工业大学》 2017年
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长链脂肪酸转运蛋白对热带假丝酵母产二元酸的影响研究

石莹  
【摘要】:长链二元酸是一种重要的化工原料和医药中间体,不能从自然界中直接获取,一般由热带假丝酵母以烷烃为底物合成,具有成本低、安全性高以及绿色环保等优点,在国内外受到普遍重视。目前,利用热带假丝酵母发酵正构烷烃生产长链二元酸的发酵工业放大技术己成熟,但随着石油资源的枯竭,以烷烃为底物生产长链二元酸面临着越来越沉重的成本和原料压力。因此,寻找廉价且可再生的原料代替烷烃,成为长碳链二元酸产业持续发展的新方向。本研究以能够催化油脂生产长链二元酸的C.tropicalis 1798为研究对象,以脂肪酸转运蛋白FATPs中的关键基因ctfat1p为目标,通过分子生物学技术对细胞内的脂肪酸转运蛋白基因(ctfat1p)进行单拷贝敲除和双拷贝敲除以及增加ctfat1p基因的拷贝数,对ctfat1p基因的功能进行了鉴定。此外,本研究还利用Plackett-Burman设计法和正交试验法优化了C.tropicalis 1798+ctfat1p的发酵培养基。论文主要结果如下:(1)以热带假丝酵母(Candida tropicalis 1798)中的ctfat1p基因为研究对象,通过一次同源单交换,将抗性基因kan~r插入至ctfat1p基因内部,实现目的基因的单拷贝敲除,并通过发酵实验分析CtFat1p在热带假丝酵母脂肪酸跨膜转运过程中的功能;结果表明,ctfat1p基因敲除对C.tropicalis 1798以油脂为底物培养12 h后重组菌OD_(600)值仅为野生型菌株的47.9%,产量降低了65.3%,表明ctfat1p基因敲除后影响C.tropicalis 1798对油脂吸收利用,可以减弱细胞对长链脂肪酸的摄取,验证了ctfat1p基因为热带假丝酵母油脂吸收和利用的关键基因。随后以hygroB为双拷贝敲除的抗性标签,通过构建pZERO-Blunt-ctfat1p2-hygroB敲除载体获得ctfat1p基因双缺失菌株;结果发现,ctfat1p基因双缺失菌株在以油脂为唯一碳源时不能正常生长、代谢,进一步推断酵母菌中的Fat1p蛋白具有促进长链脂肪酸转运的活性。(2)基于以上研究,在获得ctfat1p基因全长的基础上,通过无缝克隆手段,获得了含有多拷贝的ctfat1p基因过表达菌株C.tropicalis 1798+ctfat1p。发酵实验表明,过表达ctfat1p基因后获得的多拷贝重组热带假丝酵母菌的DCA产量较热带假丝酵母原始菌相比提高了30%,且菌体正常生长。由此可知,ctfat1p基因拷贝数增加后酵母吸收利用油脂的能力增强,表明ctfat1p基因为热带假丝酵母油脂吸收的关键基因。(3)通过一系列的实验优化了发酵重组菌株C.tropicalis 1798+ctfat1p产DCA的培养基组成。通过Plackett-Burman实验设计确定了影响DCA产量的4种重要培养基组成成分,分别为MgSO_4·7H_2O、(NH_4)_2SO_4、Na_2HPO_4·12H_2O和KH_2PO_4;通过正交试验法分析得到DCA生产的最优发酵培养基(摇瓶):(NH_4)_2SO_4 1 g/L、酵母浸粉2 g/L、VB_1 0.2 g/L、KH_2PO_4 6 g/L、Na_2HPO_4·12H_2O10 g/L、MgSO_4·7H_2O 2 g/L、葡萄糖62.5 g/L;以此培养基在摇瓶中发酵测得的DCA产量为8.78 g/L,比优化前的培养基产二元酸提高了28.6%。
【学位授予单位】:齐鲁工业大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:TQ921;Q78

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