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《齐鲁工业大学》 2019年
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β-葡萄糖苷酶的异源表达以及CRISPR-Cas9系统在草酸青霉中的应用

王亚南  
【摘要】:随着石化燃料消耗速率的不断增加,环境和资源危机日益加剧。因此,迫切需求生物乙醇、生物柴油和生物氢等替代型能源。植物来源的生物质是地球上最为丰富的可再生资源。利用植物生物质原料向生物燃料和化学品的高效转化可以有效地缓解能源和环境危机。丝状真菌可高效地表达木质纤维素酶,降解植物生物质,对自然界的碳循环发挥着重要的作用。目前,在丝状真菌中,木质纤维素酶系的低水解效率导致的酶使用高成本是木质纤维素生物质经济转化中的主要瓶颈。丝状真菌木质纤维素降解酶系由多种水解酶组成,主要包括外切纤维素酶、内切纤维素酶和β-葡萄糖苷酶。β-葡萄糖苷酶是纤维素酶系中重要的组分之一,其主要作用是将纤维寡糖或纤维二糖水解为葡萄糖,对纤维素的降解有重要作用,但其含量占整个酶系的比重相对较低,成为限制纤维素酶高效转化生物质资源的重要因素。因此,以木质纤维素酶高产菌株草酸青霉(Penicillium oxalicum)为靶点,重构纤维素酶系的表达调控,构建产β-葡萄糖苷酶高性能菌株,对增强纤维素酶在生物质资源的高效转化应用方面具有重要意义。本论文主要研究成果如下:1.黑曲霉β-葡萄糖苷酶基因在草酸青霉中的异源表达前期研究中,构建了一株纤维素酶高产菌株草酸青霉PT3-1,其纤维素酶表达水平相比出发菌株有大幅度提高,但β-葡萄糖苷酶的表达量相对较低。因此,设想在草酸青霉中异源表达其它丝状真菌来源的β-葡萄糖苷酶的方式来解决这一问题。已有研究结果发现,来源于黑曲霉的β-葡萄糖苷酶具有较高的比活力,且葡萄糖耐受性较高,这将利于提高对纤维素的降解效率。本实验中,我们构建了三种β-葡萄糖苷酶(来源于黑曲霉)的过表达盒,分别以草酸青霉的bgl2启动子、cbh1启动子和PDE_02864基因启动子作为黑曲霉β-葡萄糖苷酶基因异源表达盒的启动子。将以上三种表达盒在高产纤维素酶菌株PT3-1中进行表达,得到了一株高产β-葡萄糖苷酶菌株C3-1。C3-1突变株在发酵120 h后β-葡萄糖苷酶活力达到172.6 U/mL,分别比野生菌株114-2和出发菌株PT 3-1提高了244倍和156倍;滤纸酶活为3.2 U/mL,分别比野生菌株114-2和出发菌株PT 3-1提高了7倍和1.5倍。得到一株高滤纸酶活菌株CD46-1,在发酵144 h的滤纸酶活最高为3.43 U/mL,分别是野生菌株114-2和出发菌株PT 3-1的7.5倍和1.6倍,其胞外蛋白也明显增多。2.优化β-rec/six重组系统构建高产β-葡萄糖苷酶菌株在前期研究结果中,已经在草酸青霉中建立了β-rec/six位点的遗传筛选标记循环利用系统。但利用该系统去除筛选标记后,β-丝氨酸重组酶基因仍留存在染色体上,这可能会对染色体上其他位点产生不利影响。通过查阅文献,对β-rec/six重组系统进行了优化,构建了在转化子基因组中无Rec重组酶痕迹的重组系统。在利用该系统去除筛选标记的同时,β-丝氨酸重组酶基因也被切除,避免了因β-丝氨酸重组酶基因的持续表达产生的不利影响。该系统可用于后续β-葡萄糖苷酶高产菌株的构建。3.CRISPR-Cas9系统在草酸青霉中的应用CRISPR-Cas9系统是一种强大的基因编辑方法,目前已广泛应用于丝状真菌中。然而,在草酸青霉中尚未报道关于该基因编辑系统的应用。本章研究中,在草酸青霉中尝试表达携带Cas9蛋白基因的质粒,并筛选了多种用于体内转录sgRNA的RNA聚合酶III型(Pol III)的启动子,构建了多种不同的sgRNA表达盒,初步探究了CRISPR-Cas9基因编辑系统草酸青霉中的应用。
【学位授予单位】:齐鲁工业大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2019
【分类号】:Q78

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