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《齐鲁工业大学》 2019年
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生防菌及生物诱抗分子在植物免疫激活及枯萎病防治方面的效应及机理研究

曹健  
【摘要】:枯萎病是一类危害严重的土传类病害,其主要的致病菌是尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum),并且可以在多种植物中诱发枯萎病。枯萎病可以发生在植物整个生长期间,危害严重,目前尚无有效的方法防治枯萎病。为了通过改变土壤中微生物的营养环境、优化微生物群落结构、提高土壤中微生物多样性而达到抑制枯萎病侵染植株,达到降低枯萎病发生的目的,同时研发生物诱抗分子和生防菌作为生防制剂,本研究在接种枯萎病病原菌条件下,开展了生防制剂使用效果和防治枯萎病的机理研究。主要实验研究结果如下:(1)本文首先选择壳聚糖和海藻多糖,采用双氧水、氢氧化钠等手段制备其寡糖,具体条件为:壳聚糖经盐酸和双氧水在60℃下处理6小时后调节pH,三倍体积乙醇沉淀后烘干制得样品;海藻多糖经双氧水在90℃下处理5小时后调节pH,50℃烘干制得样品;地衣芽孢杆菌A2-10经摇瓶优化及单因素实验优化出最优发酵培养基后经过20 L发酵罐优化发酵参数,最后经过500 L发酵罐中试放大得到聚谷氨酸,最终聚谷氨酸的发酵条件为蛋白胨2%,无水氯化钙0.2%,麦芽糊精1%,无水硫酸镁0.1%,氯化钠0.5%,谷氨酸钠5.4%,pH经氨水调节控制在6.5-7.5之间,流加方式补充12%的60%葡萄糖溶液,聚谷氨酸含量为36 g/L,粘度达到了4900 mPa.s。聚谷氨酸经加热优化处理得到样品。最后对所提取的3种样品通过GPC测分子量,得出平均分子量分别为1560/1470/1410 Da,聚合度约为9-10,属于寡糖的范畴。(2)本文选择哈茨木霉T22 B1-2和淡紫拟青霉B10-1菌株,采用固体发酵方式制备孢子粉,首先对发酵温度、物料厚度、水分、接种量等进行了单因素及正交优化,条件分别为:哈茨木霉T22 B1-2以木薯渣为基质,以5%的葡萄糖为碳源,以7%的豆饼粉为氮源,控制初始pH为6,调节物料含水量在50%,控制装料厚度在5 cm,选择8%的接种量,通过浅盘发酵的方式在30℃的条件下发酵7 d,最终哈茨木霉T22 B1-2的平均产孢量为51.2×10~8个/g;淡紫拟青霉B10-1以木薯渣为基质,以7%的糖蜜为碳源,以5%的豆饼粉为氮源,控制初始pH为6,调节物料含水量在50%,控制装料厚度在7 cm,选择6%的接种量,通过浅盘发酵的方式在30℃的条件下发酵7 d,最终淡紫拟青霉B10-1的平均产孢量为27.5×10~8个/g。最后发酵完成的物料添加5‰的海藻糖放置在恒温干燥箱内进行低温(30-40℃)烘干,哈茨木霉T22 B1-2和淡紫拟青霉B10-1的孢子存活率最高,较空白分别提升37.29%和37.81%,粉碎后混匀,获得孢子粉。(3)随后,我们构建了基于叶片侵染的防效评价方案,首先从发病的香蕉植株中分离纯化得到一株病害真菌C1-1,经过分子生物学鉴定并通过采用邻接法构建系统发育树证明C1-1为尖镰孢菌,与报道的引起枯萎病发病的主要病害菌相吻合;接下来对美国大叶菠菜、田七、乌塌菜、油菜、小白菜、油麦菜6种叶片进行了侵染效果对比,根据侵染程度选择了美国大叶菠菜;根据侵染效果对病原菌培养时间、温度、侵染时间和温度进行优化,最终确定病原菌培养5天,温度30℃,侵染时间4天,温度为28℃时侵染效果最佳;接下来基于叶片侵染实验对生物诱抗分子的防效进行初筛,根据侵染叶片后病斑的大小最终筛选出壳聚糖和葡聚糖两种生物诱抗分子抑菌率为38.26%和37.32%(多菌灵处理后的抑菌率为32.85%)。(4)进而,我们以模式生物拟南芥为对象开展诱抗剂的诱抗效果及机制分析,首先建立侵染模型,具体条件为培养温度22℃,光照16 h,黑暗8 h;侵染通过灌根方式添加10 mL菌活为10~6-10~7 cfu/mL的尖镰孢菌C1-1,生防菌在侵染前4-5天通过灌根方式添加10 mL菌活为10~6-10~7 cfu/mL的菌液,生物诱抗分子采用叶片喷施方式喷10 mL。(5)我们围绕所构建侵染模型,开展了茉莉酸途径和水杨酸钠途径关键基因PDF1.2和PR1的转录表达分析,提取实验条件的拟南芥基因组,经过RT-PCR分析,发现葡聚糖使水杨酸途径PR1基因上调表达105倍,壳聚糖使茉莉酸途径的PDF1.2基因上调表达255倍。这也印证了基于叶片侵染防效初筛以壳聚糖和葡聚糖为主的生物诱抗分子是能够激活植物免疫系统。(6)最后,我们分析了生防菌株对拟南芥根际微生物菌群结构的影响,结果显示,施加哈茨木霉T22 B1-2的土壤样品能明显降低病害菌的多样性和丰富度,即含量的下降,包括尖镰孢菌数目的下降,并且使菌群结构有了明显的变化;施加淡紫拟青霉B10-1和绿色木霉B1-1的土壤样品降低了细菌菌群结构的多样性和丰富度,提高了真菌的丰富度和多样性,但大多数为病原菌,并且也降低了尖镰孢菌的含量,在拟南芥中并没有体现出来。这一结果与生防实验的结果相吻合。综上所述,本文初步探索了采用生防菌和生物诱抗分子的两种方式抑制尖镰孢菌的生长,防治枯萎病的发生。本研究结果不仅为生物防治枯萎病提供了借鉴,补充了枯萎病的防治手段,为以后的农业产业的发展提供了帮助。
【学位授予单位】:齐鲁工业大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2019
【分类号】:S476;S436.68

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【参考文献】
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