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《齐鲁工业大学》 2019年
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芽孢表面展示海藻糖合酶重组枯草芽孢杆菌的构建及应用

杨少杰  
【摘要】:表面展示是将异源多肽和蛋白质固定在噬菌体、细胞或芽孢表面的一种分子生物学技术,而目前已经完成了枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis的全基因组测序,并且它具有食品安全性,其产生的芽孢也具有极高的安全性,更方便于构建芽孢表面展示系统。海藻糖具有在极端环境下保护生物大分子生命体特征的生物学功能,目前,已实现海藻糖规模化生产的方法为酶法,包括双酶法和单酶法。单酶法是在海藻糖合酶(TreS)作用下,直接将麦芽糖异构为海藻糖的方法。该方法过程简单,易于操作,引起了各国科学家的重视。针对上述内容,本文开展了以下研究工作:(1)选取了11种芽孢衣壳蛋白分别将EGFP展示在B.subtilis WB800n芽孢表面。通过Western Blot及免疫荧光分析,证明已成功将EGFP分别展示在11株重组菌的重组芽孢表面,并得到了不同衣壳蛋白所展示EGFP荧光强度大小的关系为:CotXCotYCotFCotCCotECotGCotVCotBCotMCotACotW。(2)根据测得的不同芽孢衣壳蛋白所展示绿色荧光强度的大小,分别选取了芽孢锚定蛋白CotX、CotY、CotF、CotC、CotE和CotG作为分子载体,构建了芽孢表面展示海藻糖合酶TreS的重组枯草芽孢杆菌。通过Western Blot及酶活性分析,证明已成功将海藻糖合酶TreS展示到B.subtilis WB800n芽孢表面,测得6株重组菌的单位菌体干重芽孢表面展示的酶活分别为3687.64 U/g(cotX),1791.16 U/g(cotY),862.18 U/g(cotF),886.11 U/g(cotC),621.96 U/g(cotE),484.51 U/g(cotG),与所测得的所展示绿色荧光强度大小的关系基本一致。(3)利用芽孢衣壳蛋白CotC和CotG同时作为分子载体,构建了在芽孢表面共展示TreS的重组枯草芽孢杆菌,通过激光共聚焦显微镜、Western Blot及酶活分析,证明已成功将TreS共展示到B.subtilis WB800n芽孢表面。TB培养基摇瓶发酵96 h后,测定共展示TreS的重组菌单位菌体干重芽孢表面展示的酶活为1511.6 U/g。利用Dot Blot分析,测得CotC和CotG蛋白分别和共同展示TreS时,单个芽孢所展示的TreS分子数分别为2.84×10~9(CotC)、1.38×10~9(CotG)和4.65×10~9(CotC+CotG)个。通过对TB培养基的优化,发酵总菌体数为1.66×10~9 cfu/mL,芽孢数为1.50×10~9cfu/mL,产芽孢率达90.36%,共展示TreS重组菌的单位菌体干重芽孢表面展示的酶活达2450 U/g。(4)敲除了芽孢萌发基因sleB和cwlJ,有效控制了表面展示TreS重组芽孢在转化体系中的萌发。通过对重组菌B.subtilis WB800n(△sleB,△cwlJ)/cotC-treS-cotG-treS的重组芽孢在不同条件下对麦芽糖的转化,证明其芽孢表面展示的海藻糖合酶TreS具有良好的热稳定性及pH耐受性,并且其芽孢在循环转化四次后仍能维持较高酶活。
【学位授予单位】:齐鲁工业大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2019
【分类号】:TQ925

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