收藏本站
《齐鲁工业大学》 2019年
收藏 | 手机打开
二维码
手机客户端打开本文

高效表达海藻糖合酶重组枯草芽孢杆菌的构建与优化

王希晖  
【摘要】:海藻糖因其独特的生物学特性,具有保护生物大分子生命体特征的功能,被广泛用于食品、药品和化妆品中。目前,被广泛认可的海藻糖制备工艺是单酶法。单酶法是在海藻糖合酶(TreS)的作用下,直接将麦芽糖转化为海藻糖。转化过程相对简单,方便操作,但该方法依然存在不足,一是TreS主要由重组大肠杆菌诱导表达获得;二是胞内表达,获得TreS需高压均质破碎,能耗高,设备投资大,且产品中易残留内毒素。针对上述两点,本论文开展了以下研究工作:(1)选取密度诱导型启动子P_(srfA)、组成型启动子P_(43)和四个时期特异性启动子P_(abrB)、P_(spoVG)、P_(LytR)、P_(mmgA)为表达元件,四个时期特异性启动子分别在细胞生长对数期、稳定期前期、稳定期和衰亡期表达,将其串联构建得到新的启动子P_(abrB-spoVG-LytR-mmgA),以pHT01质粒为表达载体,构建了自诱导表达海藻糖合酶的重组枯草芽孢杆菌,并将重组菌分别在摇瓶和发酵罐中发酵验证,得到表达酶活高的重组菌B.subtilis WB800n/pHT01-P_(43)-treS,胞内酶活达到3937 U/g。(2)以启动子P_(srfA)、P_(43)和P_(abrB-spoVG-LytR-mmgA)为表达元件,选取枯草芽孢杆菌Tat分泌途径信号肽中最典型的两个信号肽PhoD和YwbN,以pHT01质粒为表达载体,构建了自诱导分泌表达海藻糖合酶的重组枯草芽孢杆菌B.subtilisWB800n/pHT01-P_(srfA)-PhoD/YwbN-treS、B.subtilis WB800n/pHT01-P_(abrB-spoVG-LytR-mmgA)-PhoD/YwbN-treS和B.subtilis WB800n/pHT01-P_(43)-PhoD/YwbN-treS,通过在5 L发酵罐中进行发酵验证,得到总酶活相对较高,且胞外酶活最高的重组菌B.subtilisWB800n/pHT01-P_(43)-PhoD-treS,胞外酶活达7954.58 U/L,总酶活达到26341.39 U/L,胞外酶活占总酶活的35%以上。(3)对构建的重组枯草芽孢杆菌B.subtilis WB800n/pHT01-P_(43)-PhoD-treS进行发酵培养基和发酵条件的优化,分析了碳源、碳源浓度、pH、温度、补料方式等对TreS胞外分泌的影响。以优化后的培养基进行重组菌的高密度发酵,通过流加蔗糖、后期控制温度的方式控制细胞生长代谢速率,提高了酶活及胞外酶活占总酶活的比例,发酵结果显示胞外酶活最高为15868 U/L,占总酶活的42%以上。
【学位授予单位】:齐鲁工业大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2019
【分类号】:TQ925

手机知网App
【相似文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 陈颖;周磊;杨丽维;李明春;张峻;;海藻糖合酶磁性交联酶聚集体的制备及其性质研究[J];南开大学学报(自然科学版);2018年06期
2 张彦琴;董春林;杨丽莉;梁改梅;李洁;杨睿;常建忠;赵巧红;张明义;;转海藻糖合酶基因玉米株系的获得及其抗旱性研究[J];山西农业科学;2016年01期
3 尚宏丽;顾英;;介孔分子筛固定化海藻糖合酶的研究[J];安徽农业科学;2012年10期
4 张相玉;刘俊梅;胡耀辉;;高产高温海藻糖合酶菌株的诱变选育[J];食品科技;2010年06期
5 张树珍,郑学勤;海藻糖合酶基因的克隆及其植物表达载体的构建[J];生命科学研究;2000年02期
6 陈红漫;訾晓男;阚国仕;马晶;;高温海藻糖合酶产生菌的诱变选育及产酶条件研究[J];食品研究与开发;2008年05期
7 贾炜珑;胡鸢雷;张彦芹;杨丽莉;林忠平;吴锜;;海藻糖合酶基因转化黑麦草及耐旱性研究[J];分子植物育种;2007年01期
8 段莹莹;赵伟;曹大鹏;张曰辉;崔巍巍;;产海藻糖合酶菌株的筛选及发酵条件的优化[J];中国酿造;2015年10期
9 王俊峰;尹尧;王萍萍;;高温海藻糖合酶释放处理条件及其酶学性质的研究[J];安徽农业科学;2010年22期
10 王朋;丁振;;海藻糖合酶产生菌株的诱变选育[J];食品研究与开发;2008年11期
中国重要会议论文全文数据库 前5条
1 张峻;陈晓云;陈颖;齐欣;魏雪生;;产海藻糖合酶嗜热菌的筛选及酶的制备和应用[A];中国农业生物技术学会第三届会员代表大会暨学术交流会论文摘要集[C];2006年
2 朱玥明;张峻;王宇凡;魏东盛;邢来君;李明春;;红色亚栖热菌CBS-01海藻糖合酶基因的克隆与表达[A];2008年中国微生物学会学术年会论文摘要集[C];2008年
3 马莺;;海藻糖的合成及相关酶系的研究进展[A];农业机械化与全面建设小康社会——中国农业机械学会成立40周年庆典暨2003年学术年会论文集[C];2003年
4 张树珍;杨本鹏;冯翠莲;陈如凯;罗敬萍;蔡文伟;刘飞虎;;灰树花海藻糖合酶基因在转基因甘蔗中的表达和对转基因植株抗旱性的改良[A];第二届热带亚热带植物资源的遗传多样性与基因发掘利用研讨会论文集[C];2006年
5 李妍;袁其朋;;海藻糖合酶的表达优化和结构改造研究[A];2015年中国化工学会年会论文集[C];2015年
中国博士学位论文全文数据库 前4条
1 王宇凡;红色亚栖热菌海藻糖合酶结构与功能的关系及定向进化的研究[D];南开大学;2012年
2 王自章;农杆菌介导海藻糖合酶基因遗传转化甘蔗研究[D];福建农林大学;2001年
3 刘俊梅;水生栖热菌海藻糖合酶体外定向进化及重组菌BL35细胞透性化技术研究[D];吉林农业大学;2011年
4 朱玥明;红色亚栖热菌海藻糖合成酶相关基因的克隆、表达以及海藻糖代谢途径的研究[D];南开大学;2009年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 任绪东;Thermobaculum terrenum海藻糖合酶的耐热和催化机制分析及其催化活性定点改造的研究[D];齐鲁工业大学;2019年
2 王希晖;高效表达海藻糖合酶重组枯草芽孢杆菌的构建与优化[D];齐鲁工业大学;2019年
3 黄珍;海藻糖合酶基因的克隆、表达及固定化研究[D];湖北工业大学;2018年
4 吕鑫;海藻糖合酶分子改造及在毕赤酵母中的分泌表达研究[D];齐鲁工业大学;2018年
5 陈慧;海藻糖合酶的高效表达及固定化[D];北京化工大学;2017年
6 雷禄旺;海藻糖合酶基因遗传转化柱花草的研究[D];华南热带农业大学;2004年
7 丁振;海藻糖合酶高产菌株的选育及酶学特性研究[D];山东轻工业学院;2007年
8 汤火龙;海藻糖合酶基因遗传转化烟草的研究[D];华南热带农业大学;2003年
9 曾艳波;干旱诱导启动子驱使下的海藻糖合酶基因遗传转化甘蔗的研究[D];华南热带农业大学;2004年
10 沈文;海藻糖合酶基因在大肠杆菌中的克隆、表达及酶学性质分析[D];石河子大学;2006年
中国知网广告投放
 快捷付款方式  订购知网充值卡  订购热线  帮助中心
  • 400-819-9993
  • 010-62791813
  • 010-62985026