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《齐鲁工业大学》 2019年
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紫球藻培养及合成藻红蛋白工艺研究

徐远超  
【摘要】:微藻作为一种生产高附加值产物的海洋微生物被社会各界广泛关注,它能够利用光、CO_2以及一些营养元素生产多种不饱和脂肪酸、多糖、蛋白质、维生素、酶和生物活性肽等。紫球藻是微藻中的一种,其富含藻胆蛋白(PB)、不饱和脂肪酸(PUFA)、胞外多糖(EPS)等高附加值产物。本实验选用由厦门大学能源学院研究小组分离、纯化和维护的紫球藻(Porphyridium purpureum CoE1)为研究对象,选择适合该藻种生长的培养基人工海水培养基(ASW)培养,通过培养条件的优化以及关键因子的调控,使细胞在较高的生长速度下达到高浓度,进而大大促进紫球藻的生长以及合成积累藻红蛋白(PE)的能力。首先,研究了不同的培养温度(20~25℃)、光照强度(55~165μmol/m~2s)以及重要的氮营养源KNO_3浓度(1~10 g/L)对紫球藻生长和各项生理指标的影响,包括:生物量、总蛋白、总脂肪酸、总碳水化合物尤其考察了对藻红蛋白含量的影响,以及它们之间的关系。设计了一种诱导培养模式,诱导紫球藻向合成积累藻红蛋白的方向发展。结果表明:在诱导模式中,阶段性调节培养温度(25℃→23℃→20℃)、光照强度(165μmol/m~2s→110μmol/m~2s→55μmol/m~2s)以及配合较高的KNO_3浓度(1g/L→4 g/L)使紫球藻合成的藻红蛋白高达229 mg/L(~3.05%d.w.),而过低的温度(20℃)、过低的光照强度(55μmol/m~2s)配合1 g/L的KNO_3浓度不利于紫球藻的生长,也会影响藻红蛋白的含量。其次,考察了从微藻紫球藻中提取纯化藻红蛋白的不同方法,并比较了各个方法的优缺点。实验结果表明:在藻粉状态下,冻融法能够最大化的提取出藻红蛋白,最高达到36 mg/L的水平,其它的方法如:超声波破碎法为24 mg/L、珠磨法为28mg/L、液氮研磨法14 mg/L。对于纯化方法,盐析法能快速有效的将藻红蛋白纯化出来,纯度能够达到2.21,回收率达到82%,而超滤法纯化后的纯度只能达到1.44,回收率为90%,两者结合后纯度能达到2.40,回收率为75%。而一步凝胶柱层析法能将纯度提高到3.10,但回收率只有54.1%。合理组合的纯化方法可以将纯度提高到4.0以上,如盐析超滤层析法中能达到5.21,但是回收率只有39.2%。所以,合理组合的纯化方法有利于提高藻红蛋白样品的纯度,但伴随着纯度的提高回收率明显下降。最后,对从紫球藻中提取纯化的藻红蛋白进行了相关性质的鉴定,比如:紫外吸收光谱的测定、荧光光谱的测定、荧光量子产率的测定、斯托克斯位移的测定、SDS-PAGE分析以及在不同温度(4℃、25℃、65℃)、酸碱度(pH 3.0、pH 5.0、pH7.0、pH 9.0、pH 11.0)条件下的稳定性等。实验结果表明,该紫球藻中的藻红蛋白属于B-PE,在545 nm有一个最大吸收峰,在564 nm处有另一个吸收峰,在499nm有一个吸收肩峰。荧光光谱显示藻红蛋白发射峰为578 nm,从而根据斯托克斯位移(Stokes shift)的公式计算可得,斯托克斯位移可达79 nm。以罗丹明B在20℃乙醇溶液中的荧光量子产率0.97为参照,相同温度下(20℃),B-PE在提取液磷酸盐缓冲溶液(PBS)中测得的荧光量子产率高达0.9。SDS-PAGE结果显示,藻红蛋白含有三个亚基(α、β、γ),藻红蛋白在高温条件(65℃)下容易失去荧光活性,在低温4℃下能长期维持荧光活性。藻红蛋白对酸碱性不敏感,但在酸性条件(pH 3.0、pH5.0)下比在碱性条件下(pH 9.0、pH 11.0)荧光活性高。总之,通过诱导培养提高了藻红蛋白含量,同时保证了较高水平的生物量,并通过冻融法、结合法最大程度的获取纯化了藻红蛋白,最后鉴定了该藻红蛋白具有高荧光性、高光稳定性、高荧光量子产率和最大限度地的斯托克斯位移等特性,在食品、化妆品、医学、分子生物学等领域可具有广泛的用途。
【学位授予单位】:齐鲁工业大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2019
【分类号】:TQ936.2;S968.4

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