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《山东农业大学》 2009年
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苹果多胺和脯氨酸合成代谢相关基因的功能鉴定

王庆莲  
【摘要】:多胺不仅调节植物的生长发育,还参与逆境响应,而脯氨酸则是一种重要的渗透保护物质。多胺和脯氨酸的生物合成代谢由一系列酶催化完成,如多胺生物合成途径中的精氨酸脱羧酶(ADC)和精胺合成酶(SPMS),脯氨酸代谢中的重要酶?1-吡咯琳-5-羧酸脱氢酶(P5CDH)等。为研究多胺和脯氨酸合成代谢的分子机理,本研究从‘Gala’苹果中克隆了MdADC、MdACL5、MdSPMS和MdP5CDH基因,其中MdADC编码ADC,MdACL5和MdSPMS均编码SPMS,MdP5CDH编码P5CDH,通过基因表达分析和转基因功能鉴定等方法,鉴定了这些基因的生物学功能。主要研究结果如下: 1.克隆了MdADC、MdSPMS和MdACL5基因的cDNA全长,构建植物表达载体pBI121-MdADC、pBI121-MdSPMS和pBI121-MdACL5,采用农杆菌介导法,将它们分别导入烟草Nc89,获得了各基因的转基因植株。 2.半定量RT-PCR分析和高效液相色谱(HPLC)测定表明MdADC、MdSPMS和MdACL5基因的过量表达均导致转基因烟草内源多胺含量增加,转基因烟草表现出植株矮化、节间缩短和叶面积增大等表型。 3.非生物胁迫抗性分析发现,MdADC、MdSPMS和MdACL5转基因烟草均对PEG、低温和盐等胁迫表现高抗。在三种胁迫下,与非转基因对照相比,各转基因株系均表现出更高的多胺含量、脯氨酸含量、抗氧化酶(SOD、POD和CAT等)活性、根系活力以及更低的MDA含量和相对电导率。同时发现,与MdACL5相比,MdSPMS转基因烟草的相关表型及抗性更明显。 4.从苹果中克隆分离出了MdP5CDH基因的cDNA全长;半定量RT-PCR分析表明,该基因在苹果各组织器官中组成型表达,开放花中表达最高;同时发现该基因的表达受低温诱导。 5.构建了MdP5CDH基因标签蛋白大小不同的原核表达载体pET-30a-MdP5CDH和pGEX-MdP5CDH,经IPTG诱导分别得到65.14 kDa和88.44 kDa特异蛋白产物,确定该基因编码蛋白大小为61.74 kD。 6.构建了MdP5CDH的正义表达载体pJIT166-MdP5CDH和反义抑制载体pBI121-RevMdP5CDH,并利用农杆菌介导法将它们分别导入‘王林’愈伤组织。半定量RT-PCR分析表明,转正义基因的愈伤组织中MdP5CDH过量表达,而转反义基因的愈伤组织中MdP5CDH表达受抑制。 7. MdP5CDH过量表达导致愈伤组织中脯氨酸含量降低,而抑制表达则使脯氨酸含量升高;各细胞系的生长曲线表明,MdP5CDH过量表达和抑制表达均影响了愈伤组织的生长。
【学位授予单位】:山东农业大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2009
【分类号】:S661.1

【引证文献】
中国硕士学位论文全文数据库 前1条
1 李强;平邑甜茶MhP5CS和MhOAT的克隆及其对镉胁迫的反应[D];山东农业大学;2011年
【参考文献】
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1 余光辉;水分胁迫下假俭草脯氨酸累积的ABA,Ca~(2+)调节[D];华南师范大学;2003年
【共引文献】
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9 王发明;柚(citrus grandis Osbeck)单染色体AFLP分子标记体系及文库的建立[D];福建农林大学;2010年
10 秦伟;新疆野苹果繁育特性及种质资源亲缘关系研究[D];新疆农业大学;2010年
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1 艾方;柑桔—糯米汁混合发酵酒的研制[D];华中农业大学;2010年
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10 乔芬;柑橘衰退病和碎叶病新型脱毒方法的研究[D];华中农业大学;2010年
【同被引文献】
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1 霍秀文;冰草组织培养再生体系建立及耐旱转基因研究[D];内蒙古农业大学;2004年
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1 李晓东;多胺在核桃雌雄花芽孕育和分化中的作用研究[D];河北农业大学;2002年
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6 记者 文婧 实习生 刘坤领;生涩苹果中国消费者未必喜欢啃[N];经济参考报;2010年
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