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《山东农业大学》 2009年
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我国葡萄根瘤蚜遗传分化研究及翅型分化相关基因的筛选

孙庆华  
【摘要】: 葡萄根瘤蚜(Daktulosphaira vitifoliae Fitch)是葡萄栽培上的毁灭性害虫。2005年我国再次发现了葡萄根瘤蚜,这对我国葡萄产业构成了巨大威胁。为了及时、有效的防治根瘤蚜,必须深入研究我国根瘤蚜的生物学、生态学和遗传特性。为此本文对我国根瘤蚜生物型进行了鉴定,对不同地理种群根瘤蚜的遗传多样性与系统发育进行了初步探讨,并对根瘤蚜翅型分化相关基因进行了筛选。主要结果如下: 1.我国葡萄根瘤蚜生物型鉴定分析 采用离体根鉴定系统对我国的6个葡萄根瘤蚜克隆的侵染能力进行了鉴定分析,结果表明:1)根瘤蚜在抗性砧木SO4、5BB、101-14M上均不能够发育为成虫,滞育在1龄。2)在敏感品种赤霞珠上,SH Kyoho克隆的成虫存活率最高,而HN Kyoho和LN Beta克隆的存活率较低。但各个克隆的日产卵量和生命表参数没有明显差异。3)综合根瘤蚜在赤霞珠、刺葡萄、贝达和140Ru上的表现,发现SH Kyoho克隆的Ro最大,rm和λ最高,DT最短,说明SH Kyoho克隆侵染能力较强。 2.我国根瘤蚜mtDNACOⅠ的遗传多样性与系统进化分析 通过线粒体DNACOⅠ多态性研究了我国葡萄根瘤蚜的遗传分化与系统发育,并将我国根瘤蚜单倍型与GenBank中已发表的83个单倍型进行了聚类分析。结果表明:1)序列中A、C、T、G四种核苷酸的比例分别为34.8%、15.8%、39.2%和10.2%,富含A+T;29个变异位点中单一多态位点12个,简约信息位点17个。2)在我国根瘤蚜群体中共确定了13种单倍型,其中上海群体单倍型相对丰富,且上海根瘤蚜种群与其它三个种群之间没有共享单倍型。3)上海群体与陕西、湖南和辽宁三个种群的遗传距离较大(0.039~0.040),Nm最小(0.02),在分子系统发育树和单倍型网络图上为独立分支,说明我国根瘤蚜至少有两个独立的来源。 3.我国葡萄根瘤蚜不同地理种群的遗传多样性分析 应用7对SSR引物对4个葡萄根瘤蚜根瘤蚜地理种群进行了遗传多样性分析。1)PIC信息指数显示除Dvit4在上海群体和陕西群体表现出高度多态之外,其他位点在所有种群中均表现为中度多态或低度多态。2)4个种群观察杂合度普遍高于期望杂合度,期望杂合度较低(0.3564~0.3730),Shannon指数的平均数都小于1.0,说明群体内遗传变异性较小,遗传多样性较差,其中上海群体的遗传多样性相对丰富。3)对4个根瘤蚜种群的遗传分化进行分析,发现83%的遗传分化多样性驻留在群体内。4)上海群体与其它群体的遗传距离较大(0.4531~0.4694),其它三个群体之间的遗传距离差别较小(0.0028~0.0114),其中湖南与辽宁群体之间的遗传距离最小,仅为0.0028。以Nei氏遗传距离进行UPGMA聚类分析获得的结果表明:4个种群明显分为两支,上海种群为独立分支,其它三个种群聚为一支,其中湖南和辽宁两大种群遗传关系较近,这与mtDNACOⅠ的结果一致。 4.抑制消减杂交(SSH)筛选翅型分化基因 以翅型分化关键期的无翅2龄和有翅2龄若蚜为试材,运用SSH技术对葡萄根瘤蚜的翅型分化机制进行了研究。从有翅蚜文库中筛选到51个特异基因片段,其中有17条ESTs为已知序列,它们代表14种基因,其它34条为功能未知的基因或检索不到匹配序列的新基因。14种ESTs功能已知按其功能可分为4类:细胞组成、物质代谢、转录因子、逆转座子。无翅文库中得到44个差异表达的ESTs序列,其中12个已知基因,8个未知功能的基因和24个与其它物种同源性较低或找不到同源性的ESTs。 5.翅型分化相关基因的荧光定量PCR分析 从有翅和无翅根瘤蚜特异表达的已知ESTs中挑选13个基因,用荧光定量PCR技术检测其在各龄期有翅蚜中的表达模式,结果表明:Brat、Apyrase、CHD和RPS 15a基因在翅型分化的关键期(有翅2龄)高表达,与无翅2龄相比达到了极显著水平,且随有翅蚜龄期的增长其表达量逐渐下降,说明这四个基因在翅型分化过程中可能起着关键作用。
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