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《山东农业大学》 2010年
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嗜热毛壳菌热稳定脂肪酶的基因克隆、表达及性质研究

郭晓红  
【摘要】： 脂肪酶(EC 3.1.1.3),全称三酰甘油酰基水解酶,广泛存在于生物体内。微生物来源的脂肪酶由于种类多、生长周期短、易于培养等特点而被广泛用于工业生产。脂肪酶能够催化油脂中甘油酯键的水解,也可催化酯交换、酯化、醇解和酸解等反应。但一般的脂肪酶热稳定性较差,在应用中易于失活,因此热稳定性脂肪酶的研究和开发具有重要的商业价值。对于热稳定脂肪酶性质和结构的研究已经成为当前脂肪酶研究的热点问题。 嗜热毛壳菌(Chaetomium thermophilum)是一种生长上限温度较高的嗜热真菌,它能够产生具有重要工业价值的热稳定脂肪酶。但是野生菌产酶存在培养温度高等较多不利因素,因而近年来主要研究方向集中于采用基因工程方法构建重组菌,进而获得稳定表达的热稳定脂肪酶。 本研究在添加橄榄油的诱导培养基上诱导C. thermophilum产生脂肪酶,根据已报道的脂肪酶同源保守序列设计兼并引物,综合运用RT-PCR、3’RACE、Tail-PCR技术克隆到脂肪酶基因的全长序列,命名为lm,其中DNA序列长1180bp,有4个内含子;cDNA序列长870bp,开放阅读框编码290个氨基酸,序列提交GenBank,登录号分别为GU338249和GU338248。 将脂肪酶基因lm编码区与酵母分泌型表达载体pPIC9K经过EcoR I和Not I双酶切后体外连接,构建酵母重组表达载体pPIC9K/lm。将重组表达质粒pPIC9K/lm用限制性内切酶Sac I线性化,电击法转化Pichia pastoris GS115酵母感受态细胞,于MD/MM平板上筛选His+Mut+表型的酵母转化子。经过PCR检测及G418抗性筛选多拷贝整合子,进行甲醇诱导培养。通过检测各转化子目的蛋白表达情况,筛选到表达活性最高的菌株GS-LM-18,在第六天酶的活性最高,达19.77 U/mg,蛋白表达量为0.428 mg/mL。 酵母工程菌株GS-LM-18在YPD平板上划线连续传代10次后,重组脂肪酶的表达量基本保持稳定。表达脂肪酶LM的最适反应温度和pH分别为60℃和10.0,该酶在60℃以下稳定,70℃的半衰期为40min,在pH值为9.0~11.0之间表达脂肪酶保持稳定的酶活性;Ca~(2+)对酶有明显的激活作用,Fe~(2+)、Zn~(2+)、K~+、Ag~+对酶有显著的抑制作用。 重组脂肪酶工程菌能分泌出具生物活性的脂肪酶,而且表达脂肪酶具有热稳定性,预示了表达的脂肪酶在生物学领域和化工工业的广阔应用前景。
【关键词】：嗜热毛壳菌 热稳定脂肪酶 cDNA克隆 表达 性质测定
【学位授予单位】：山东农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2010
【分类号】：Q78
【目录】：
  • 摘要10-12
  • Abstract12-14
  • 1 引言14-36
  • 1.1 脂肪酶的研究进展14-29
  • 1.1.1 脂肪酶的命名14-15
  • 1.1.2 脂肪酶结构15-18
  • 1.1.3 脂肪酶的催化机理18-20
  • 1.1.4 脂肪酶的特性20-23
  • 1.1.5 几种脂肪酶活力的测定方法23-27
  • 1.1.6 脂肪酶的应用27-29
  • 1.2 毕赤酵母表达系统29-31
  • 1.3 嗜热真菌和热稳定脂肪酶31-33
  • 1.3.1 嗜热真菌31-32
  • 1.3.2 产热稳定脂肪酶微生物32-33
  • 1.4 本研究的立题依据、研究内容及技术路线33-36
  • 1.4.1 立题依据33-34
  • 1.4.2 研究内容34-35
  • 1.4.3 技术路线35-36
  • 2 材料与方法36-62
  • 2.1 材料36-39
  • 2.1.1 供试菌株36
  • 2.1.2 质粒36
  • 2.1.3 酶和生化试剂36
  • 2.1.4 仪器36-37
  • 2.1.5 溶液配制37-38
  • 2.1.6 培养基配制38-39
  • 2.2 嗜热毛壳菌脂肪酶的基因克隆及其序列分析39-48
  • 2.2.1 引物设计39
  • 2.2.2 总RNA 的提取（Trizol 法）39-40
  • 2.2.3 反转录cDNA 第一链的合成40-41
  • 2.2.4 目的基因cDNA 3’端的分离及测序41-45
  • 2.2.5 目的基因5’末端TAIL-PCR 扩增45-46
  • 2.2.6 目的基因DNA 序列和全长cDNA 的克隆46-48
  • 2.3 嗜热毛壳菌热稳定脂肪酶基因在毕赤酵母中的表达48-58
  • 2.3.1 脂肪酶基因lm 成熟肽基因序列的分离48-49
  • 2.3.2 质粒提取49-50
  • 2.3.3 酵母表达载体的构建50
  • 2.3.4 线性化质粒DNA 的制备50-51
  • 2.3.5 酵母转化51-52
  • 2.3.6 酵母转化子的筛选与鉴定52-56
  • 2.3.7 酵母工程菌的培养和LM 的诱导分泌表达56-57
  • 2.3.8 重组脂肪酶的活性检测57
  • 2.3.9 表达产物LM 的SDS-PAGE 分析57
  • 2.3.10 脂肪酶工程菌产酶曲线及产酶期间生长曲线的测定57-58
  • 2.4 重组脂肪酶的纯化58-59
  • 2.4.1 发酵液的硫酸铵沉淀58
  • 2.4.2 DEAE-Sepharose 阴离子交换柱层析58
  • 2.4.3 蛋白质分子量测定和纯度鉴定58-59
  • 2.4.4 蛋白质含量测定59
  • 2.5 表达脂肪酶酶学特性的研究59-62
  • 2.5.1 脂肪酶工程菌的遗传稳定性分析59
  • 2.5.2 反应最适温度59
  • 2.5.3 反应最适pH 值59-60
  • 2.5.4 热稳定性60
  • 2.5.5 pH 稳定性60
  • 2.5.6 各种金属离子对脂肪酶活性的影响60
  • 2.5.7 酶的化学修饰60-62
  • 3 结果与分析62-92
  • 3.1 嗜热毛壳菌脂肪酶的基因克隆及其序列分析62-66
  • 3.1.1 C. thermophilum 总RNA 的提取62
  • 3.1.2 Chaetomium thermophilum Genomic DNA 的提取62-63
  • 3.1.3 脂肪酶基因cDNA 3’端的的分离63-64
  • 3.1.4 脂肪酶基因DNA 序列5’-末端的分离64-65
  • 3.1.5 脂肪酶基因全长序列的验证65-66
  • 3.1.6 脂肪酶基因全长DNA 和cDNA 的分离66
  • 3.2 脂肪酶基因的核苷酸序列和氨基酸序列分析66-73
  • 3.2.1 脂肪酶基因的核苷酸序列及推测的相应氨基酸序列66-68
  • 3.2.2 脂肪酶基因的核苷酸序列分析68-69
  • 3.2.3 脂肪酶基因的氨基酸序列分析69-71
  • 3.2.4 脂肪酶的立体结构预测71
  • 3.2.5 脂肪酶的功能结构域预测71-72
  • 3.2.6 脂肪酶基因lm 结构及加工后的修饰分析72
  • 3.2.7 目的基因lm 的氨基酸序列同源性比较72-73
  • 3.3 嗜热毛壳菌热稳定脂肪酶基因在毕赤酵母中的表达73-84
  • 3.3.1 脂肪酶基因lm 序列的限制性酶切位点分析结果73-74
  • 3.3.2 脂肪酶基因lm 成熟肽序列的扩增74-75
  • 3.3.3 酵母表达载体的构建和鉴定75-77
  • 3.3.4 重组酵母转化子的筛选77-81
  • 3.3.5 脂肪酶基因lm 在Pichia pastoris 中的高效表达及表达产物的检测81-84
  • 3.4 重组脂肪酶的的纯化84
  • 3.5 表达脂肪酶酶学特性的研究84-92
  • 3.5.1 脂肪酶酵母工程菌的遗传稳定性分析84-85
  • 3.5.2 表达脂肪酶LM 的最适反应温度85
  • 3.5.3 表达脂肪酶LM 的最适反应pH 值85-86
  • 3.5.4 表达脂肪酶LM 的热稳定性86-87
  • 3.5.5 表达脂肪酶LM 的pH 稳定性87
  • 3.5.6 金属离子对表达脂肪酶LM 活性的影响87-88
  • 3.5.7 表达脂肪酶LM 的化学修饰88-92
  • 4 讨论92-99
  • 4.1 嗜热毛壳菌脂肪酶的基因克隆92-93
  • 4.1.1 RNA 提取92
  • 4.1.2 基因克隆新方法92
  • 4.1.3 脂肪酶基因的结构92-93
  • 4.2 重组脂肪酶在中温菌毕赤酵母中的表达93-96
  • 4.2.1 表达载体构建93-94
  • 4.2.2 不同线性化酶对转化效率的影响94
  • 4.2.3 表达系统比较94-95
  • 4.2.4 蛋白的翻译及加工95-96
  • 4.3 重组脂肪酶的纯化及化学修饰96-99
  • 4.3.1 脂肪酶的纯化96
  • 4.3.2 脂肪酶的遗传稳定性96-97
  • 4.3.3 脂肪酶的热稳定性97
  • 4.3.4 脂肪酶的pH 稳定性97-98
  • 4.3.5 脂肪酶的化学修饰98-99
  • 5 结论99-100
  • 参考文献100-109
  • 致谢109-110
  • 攻读硕士期间发表论文110

【参考文献】
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