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《山东农业大学》 2010年
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Pseudomonas mediterranea G-229-21T铁载体相关基因purL的克隆及功能分析

路晓萌  
【摘要】: 菌株G-229-21T为在限铁条件下从烟草根际中筛选到的一株能够产生高亲和力铁载体的地中海假单胞菌(Pseudomonas mediterranea)。用抗生素平板法对P. mediterranea G-229-21T进行抗药性试验,结果表明G-229-21T对卡那霉素敏感,能够耐受浓度的20μg/mL氯霉素。利用转座子Tn5-1063a对G-229-21T进行转座子插入诱变,筛选出1株铁载体合成缺失突变株:G-229-21TA,并以P. mediterranea特异性引物PC5/1和PC5/2进行特异性扩增证实了突变株由出发菌株突变而来。根据转座子Tn5-1063a上luxA序列特异引物,分别以G-229-21T总DNA、突变株总DNA进行PCR扩增后证明突变株G-229-21TA的luxA序列与已知的luxA序列同源性为100%,即转座子Tn5-1063a已插入到G-229-21T基因组中。 根据转座子Tn5-1063a两端的已经报道的3个嵌套引物,及7个随机引物,用TAIL-PCR(Thermal asymmetric inter laced PCR)方法,从突变株G-229-21TA中克隆到铁载体合成相关基因purL。采用兼并引物PCR和TAIL-PCR法,获得了完整的P. mediterranea G-229-21T基因序列purL。该基因与Pseudomonas fluorescens Pf-5 purL基因的同源性最高为90 %。purL编码甲酰甘氨脒核苷酸合成酶(FGAM synthetase),在嘌呤核苷酸的合成途径中催化第四步由甲酰甘氨酰胺核苷酸到甲酰甘氨脒核苷酸的转变过程。 研究表明由于嘌呤途径的阻断将导致许多依赖于ATP的生化反应不能正常进行,一些以嘌呤为必需基团的酶也会失活,因此嘌呤合成途径具有复杂效应。另外,微生物铁载体的合成和运输是一个十分复杂的过程,同时,微生物铁载体代谢途径受到影响也会影响微生物铁载体的合成或者运输。因此得出结论,purL基因与铁载体的合成有关,并对purL基因尝试进行了启动子区扩增及功能分析。
【学位授予单位】:山东农业大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2010
【分类号】:Q93;Q78

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【参考文献】
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