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《山东农业大学》 2010年
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多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)SC2 fus基因簇的克隆与分析

赵丽明  
【摘要】: 多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)SC2是一株从辣椒根际分离筛选的根际促生细菌,该菌株抗菌谱广,对辣椒根腐病原菌( Fusarium solani)、黄瓜枯萎病原菌(Fusarium oxysporum f. sp. cucumerinum)、黄瓜霜霉病原菌(Pseudoperonospora cubensis)、芹菜灰霉病原菌(Botrytis cinerea Pers)以及西红柿灰霉病原菌(Botrytis cinerea)等具有良好的拮抗效果。 用已报道的检测非核糖体肽合成酶(non-ribosomal peptide synthetases, NRPSs)基因保守区的兼并引物TGD和LGG为引物,以多粘类芽孢杆菌(P. polymyxa )SC2的基因组DNA为模板进行PCR扩增,获得一段长度为497bp的NRPS基因保守区序列。采用热不对称交错PCR(TAIL-PCR)方法,以SC2菌株基因组DNA为模板,根据NRPS基因保守区序列,分别向两侧设计特异性引物,扩增该已知序列的两侧序列。随后,通过多次特异性引物设计,进行TAIL-PCR。同时,根据枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)bamC、mycC、ituC和解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)FZB42 bmyC的同源序列,设计兼并引物进行PCR扩增,将得到的所有序列拼接,得到长度为19844bp的DNA序列。 经BLAST比对发现,此DNA序列与P. polymyxa PKB1中fus基因簇具有很高的相似性,因此,根据P. polymyxa PKB1中fusA基因簇与本试验获得的DNA序列的同源区域设计一系列兼并引物,进行特异性扩增,最终得到一条32680bp的DNA序列。 将得到的总长为32680bp的DNA序列提交GenBank,获得序列号为EU431181,该序列包含8个ORF,即fus基因簇,这8个ORF分别为fusG,fusF,fusE,fusD,fusC,fusB,fusA,fusTE,其核苷酸序列与多粘类芽孢杆菌(P. polymyxa) PKB1中对应的fusG,fusF,fusE,fusD,fusC,fusB,fusA,fusTE的相似性分别为90.61%,93.42%,91.75%,85.54%,83.29%,89.95%,88.97%,82.88%;其衍生氨基酸序列与多粘类芽孢杆菌(P. polymyxa)PKB1中对应的FusG,FusF,FusE,FusD,FusC,FusB,FusA,FusTE的相似性分别98.77%,99.15%,98.28%,90.64%,96.31%,97.78%,96.81%,和76.35%。另外,通过NCBI-BLAST,对fus基因簇的每个ORF进行了初步的功能分析。 fusA为一个完整的23727bp的ORF,编码7908个氨基酸,对其多肽序列进行结构域分析,结果表明,该多肽序列包含六个模块,分别为C-A-T、C-A-T-E、C-A-T、C-A-T-E、C-A-T-E和C-A-T;六个模块中的前五个模块的A结构域的特异性底物分别为L-Thr,D-Val,L-Tyr,D-Thr和D-Asn,但是第六个模块中特异性底物尚不能完全确定,通过构建系统发育树可以推测得到,多粘类芽孢杆菌(P. polymyxa)SC2的FusA-A6的结构域的特异性底物为D-Ala。预测的氨基酸残基组成、顺序与多粘芽孢杆菌(Bacillus polymyxa )KT-8产生的fusaricidin C和多粘芽孢杆菌(Bacillus polymyxa )L-1129产生的LI-F03a的第1、2、3、4、5、6位上氨基酸残基组成和顺序完全一致,因此,可以初步判断P. polymyxa SC2可能产生具有抗真菌活性的fusaricidin C。多粘类芽孢杆菌(P. polymyxa)SC2的FusA的六个A结构域的氨基酸序列与多粘类芽孢杆菌(P. poly- myxa)PKB1的FusA的A1、A2、A3、A4、A5和? A6结构域的相似性分别为94.13%、94.82%、91.52%、94.55%、95.34%和96.73%;其对应的核苷酸序列同源性分别为86.95%、89.00%、82.18%、89.38%、87.31%和89.49%。
【学位授予单位】:山东农业大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2010
【分类号】:S476

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