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《山东农业大学》 2010年
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向日葵菌核病根际拮抗菌的筛选、鉴定及其作用机理的初步研究

侯启会  
【摘要】: 从内蒙古巴彦淖尔盟乌拉前旗农田采集6个向日葵根际土壤样品,通过梯度稀释法和平板对峙培养法,获得640个细菌分离物。以向日葵菌核病菌(Sclerotinia sclerotiorum)为靶标菌,通过平板对峙法获得了18个具有拮抗性能的分离物,其中XRK1、XRK2、XRK4、XRK5、XRK9的拮抗能力较强,较稳定,具有良好的生防应用潜力。 通过形态观察、生理生化测定和16S rDNA测序分析,将XRK1鉴定为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis),XRK2鉴定为链霉菌(Streptomyces sp.),XRK4鉴定为地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis),将XRK5鉴定为辣椒溶杆菌(Lysobacter capsici),将XRK9鉴定为油菜假单胞菌(Pseudomonas brassicacearum)。 β-1,3-1,4葡聚糖酶活性检测表明,地衣芽孢杆菌(B.slicheniformis)XRK4能产生高效,稳定的葡聚糖酶,且XRK4能够降解向日葵菌核病菌—核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)的细胞壁。根据已报道的芽孢杆菌葡聚糖酶基因的保守序列,设计扩增XRK4的β-1,3-1,4-葡聚糖酶基因保守序列的引物PJTM3(5'-CCGGATTATGGCAAAAAGC-3'),PJTM4(5'-GAGCCAGTCATCGACACCT-3')。通过PCR扩增,得到580bp的DNA片段。将序列测定结果在NCBI上进行BLAST分析,选择同源性最高的基因序列作参考,设计能扩增XRK4β-1,3-1,4-葡聚糖酶基因完整阅读框架的引物PJTM5和PJTM6、PJTM7和PJTM8。通过PCR扩增,得到732bp的DNA片段。BLAST分析表明,所得到的葡聚糖酶基因完整阅读框架与已报道的β-1,3-1,4-葡聚糖酶bglA(AY365256)基因的完整阅读框架相似性最高,达到了99%。基因的活性位点分析表明, XRK4的β-1,3-1,4-葡聚糖酶基因具有高度保守的β-1,3-1,4-葡聚糖酶的色氨酸,谷氨酸,天冬氨酸,谷氨酰胺活性位点。 用抗生素平板法对油菜假单胞菌(P. brassicacearum)XRK9进行抗药性试验,XRK9对卡那霉素敏感,能够耐受20μg/mL以上的氯霉素。利用转座子Tn5-1063a对XRK9进行转座子插入诱变。用XRK9特异性引物,以突变株基因组为模板进行了特异性扩增,初步证实了突变株由出发菌株突变而来。根据转座子Tn5-1063a上的luxA序列,设计引物,分别以XRK9总DNA、pRL1063 DNA和突变株总DNA进行PCR扩增,测序结果表明,突变株的luxA序列与已知luxA的序列同源性为100%,由此证实转座子Tn5-1063a插入到XRK9基因组中。 经发酵,盐析,透析和平板对峙实验表明,油菜假单胞菌(P. brassicacearum)XRK9的胞外蛋白对向日葵菌核病菌具有拮抗效果。利用非变性PAGE分离出拮抗活性蛋白,利用SDS-PAGE检测蛋白分子量。对拮抗蛋白理化性质研究表明,该蛋白在60%硫酸铵盐析浓度下具有较高的活性,是一种亲水性蛋白,能抵制120oC以上的高温,对蛋白酶K和氯仿不敏感,对紫外线有较强较稳定性的蛋白。
【学位授予单位】:山东农业大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2010
【分类号】:S435.655

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【引证文献】
中国期刊全文数据库 前1条
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【参考文献】
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