引入新的二硫键对植酸酶结构和功能的影响

仲伟磊

【摘要】： 在饲料中添加植酸酶可提高植物性饲料中磷的利用率和单胃动物对矿质元素的吸收率,并减轻动物排泄物中磷对环境的污染。在生产酶制剂的过程中改善植酸酶的稳定性是亟待解决的问题。随着基因工程的发展,在分子水平上对酶基因进行改造为改良酶蛋白开辟了一条新的途径。对于蛋白质来说,稳定的构象是行使其功能的基础。二硫键是蛋白质分子侧链间唯一的共价键,对蛋白质结构的稳定及功能都有重要的作用。植酸酶PHYA中共含有五对二硫键(Cys12-Cys21,Cys52-Cys395,Cys196-Cys446,Cys245-Cys263,Cys417-Cys425),通过生物信息学软件的应用,利用定点突变技术,在植酸酶的特定位点引入新的二硫键,通过研究新引入的二硫键对植酸酶结构和功能的影响,探讨在设计新的二硫键引入时的思路和研究方法不足的问题,建立一个合理的引入二硫键的技术策略,为利用蛋白质工程技术改造获得具有工业应用潜力的商品酶提供一个理论基础。 1.通过蛋白质同源序列的比对,获得黑曲霉Aspergillus niger植酸酶的3D构象模拟图,通过生物信息学分析软件Disulfide by Design~(TM),分析研究了在植酸酶基因序列中可能存在的二硫键位点,利用SWISS-MODEL、Swiss-PdbViewer以及拉氏构象图,选择其中适当的位点进行定点突变,构建了六个突变体菌株:MP19/34、MP32/246、MP111/253、MP193/318、MP32/246/111/253和MP32/246/193/318,引入了新的二硫键。构建的植酸酶突变体均在毕赤酵母中得到表达。 2.对发酵产生突变的植酸酶进行纯化,SDS电泳分析表明,突变植酸酶的表观分子量没有明显变化。通过DTNB处理,分析表明,在突变体中没有自由巯基的存在,说明成功地在突变体中引入了新的二硫键。通过DTT变性和DsbA复性,结果表明变性前后酶活力没有明显差别,说明新引入的二硫键并没有引起原来的五对二硫键的错配。 3.对酶的催化活力测定表明,纯化后的植酸酶单位毫克蛋白的催化活力(比活力),突变体MP111/253的活力与野生型植酸酶相似,而MP193/S318的活力与野生型相比变化明显,下降了约20%。通过酶动力学参数分析发现,突变体的K_m值明显降低,表明与野生型相比,突变体植酸酶明显比野生型具有更高的底物结合能力。 4.对植酸酶最适pH的研究表明,突变体植酸酶在酸性pH范围内具有较高的活性,其中突变体MP111/253在pH2.5和5.0具有最高活性,突变体MP193/S318在pH2.0和5.0具有最高活性。突变体MP111/253在pH5.0到6.0的范围内活力变化很小,在pH6.0时,保留有95%的活力,而野生型下降为75%;突变体MP193/S318在pH2.0到3.0活力变化不明显,表明突变体植酸酶比野生型具有较为宽广的pH范围。 5.热稳定性分析表明,在60℃处理15min,突变体MP193/318的剩余活力大约为72%,突变体MP111/253大约为50%,野生型大约为60%。在80℃处理15min,野生型和突变体植酸酶的活力均下降为40%左右。

【关键词】：二硫键 植酸酶 定点突变 热稳定性 K_m
【学位授予单位】：山东农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2010
【分类号】：Q55
【目录】：

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7	丁海涛;依赖型葡萄糖脱氢酶的研究[D];浙江大学;2010年
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6	刘雨田,晏向华,郭小权;植酸酶的研究进展[J];国外畜牧学(猪与禽);1999年06期
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7	刘方;苟凌波;;催化氢解催化剂的研究进展[A];第1届全国工业催化技术及应用年会论文集[C];2004年
8	李虎;罗立文;于慧征;鲍新宁;夏道宏;;丁硫醚在Ce-HZSM-5上的转化反应研究[A];第2届全国工业催化技术及应用年会论文集[C];2005年
9	许以明;张志义;;喇曼光谱对光敏损伤的蛋白质溶液构象的研究[A];中国物理学会光散射专业委员会成立十周年暨第六届学术会议论文集（上）[C];1991年
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