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《山东农业大学》 2010年
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桑树中产1-脱氧野尻霉素微生物的研究

叶晶晶  
【摘要】: 1-脱氧野尻霉素(DNJ)是一种α-葡萄糖苷酶抑制剂,能有效抑制糖吸收,降低血糖值。桑作为具有良好降血糖效果的中药,其降血糖的主要有效成分DNJ的含量已经被测定。前人已经对不同桑品种、不同叶位、不同蚕品种以及不同发育阶段的蚕体、蚕沙、蛹等的DNJ含量做了大量的研究。目前许多蚕桑原料已被开发为降血糖产品用于临床。 目前已从多种微生物和植物中检测到DNJ及其类似物,植物中以桑树中的DNJ含量最高,家蚕体内的DNJ来源于桑叶。但关于桑树中DNJ的确切来源还没有定论,一般认为桑树中的DNJ是由桑树自身合成的,但研究表明植物体内的很多次生代谢产物都是由体内的共生微生物产生的,DNJ也是在链霉菌中首次被发现的。为探讨桑树中的DNJ来源,本文通过对桑树内生菌(细菌、真菌、放线菌)的分离,利用RP-HPLC-UV法对分离株能否产生DNJ进行检测,发现桑树体内的确存在能够产生DNJ的内生菌。进一步对分离获得的产DNJ性质稳定的菌株进行了鉴定、对其中一菌株产DNJ的发酵条件和发酵培养基进行了优化,对发酵产物进行了初步的分离鉴定,最后通过动物试验,对产DNJ内生菌发酵液的安全性及其降血糖效果进行检测,主要取得以下结果。 1分离桑树、组培苗及桑籽中的内生菌。利用RP-HPLC-UV法检测分离株中DNJ的产生情况,共分离得到10株产DNJ的内生细菌分离株,经Rep-PCR鉴定,归类为6株能够产生DNJ的内生细菌,其中菌株Y1、Y2产DNJ的性质稳定。 2对菌株Y1、Y2进行了系统的分类学鉴定。主要包括:菌株形态观察、生理生化指标测定、自动细菌鉴定仪鉴定、脂肪酸分析及16S rDNA序列分析。结果表明, Y1菌株属于嗜麦芽寡养假单孢杆菌(Stenotrophomonas maltophilia),菌株的16S rDNA序列已在Genbank中注册,登录号为GQ268318;Y2菌株属于藤黄微球菌(Micrococcus luteus),菌株的16S rDNA序列已在Genbank中注册,登录号为GU591156。 3通过摇瓶培养方法,探讨了发酵条件和发酵培养基对Y1菌株产DNJ的影响。 利用单次单因子试验确定了摇瓶培养的最佳发酵条件为:接种量2%(v/v)、摇瓶装液量50mL/250mL、发酵温度30℃、初始pH6.0。在此基础上通过单次单因子试验确定了发酵培养基的最佳碳源、氮源、碳氮比、无机盐。运用PB试验分析了培养基组分:麦芽糖、蛋白胨、尿素、硫酸镁、氯化钠对Y1菌株产DNJ的影响。结果表明,蛋白胨和硫酸镁对Y1菌株产DNJ的影响达到极显著水平;尿素对Y1菌株产DNJ的影响达到显著水平;而麦芽糖和氯化钠对Y1菌株产DNJ的影响不显著。通过最陡爬坡路径逼近最大响应区域,最后用中心组合设计和响应面分析,确定了发酵培养基中主要影响因子的最佳浓度。 最优发酵培养基配方为:麦芽糖40.00g、蛋白胨14.29g、尿素7.39g、MgSO4 0.77g、NaCl 1.00g、蒸馏水1000mL。 运用最佳发酵条件和最佳发酵培养基进行摇瓶培养,利用RP-HPLC-UV法测得衍生化后DNJ的峰面积达到了102.9mAU*min,较基础发酵培养基提高了227.21%。 4对Y1菌株产生的DNJ进行了初步分离鉴定。获得了DNJ粗提物,并采用RP-HPLC-UV以及MS对所得DNJ粗提物进行了检测。RP-HPLC-UV结果显示,发酵液中的DNJ得到初步纯化;MS分析结果表明,Y1菌株发酵产生的DNJ与桑叶中DNJ性质相同(离子峰的出峰位置一致)。 5通过动物试验对Y1菌株发酵液的安全性及降血糖效果进行了研究。试验结果表明,Y1菌株的发酵液对小鼠安全,并且具有明显的降血糖作用,能够有效缓解糖尿病小鼠“三多一少”的症状。
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