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《山东农业大学》 2010年 硕士论文
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山东某地方品系鸡鸡胚中禽白血病病毒的分离及序列分析

朱美真  
【摘要】: 禽白血病病毒(ALV)是最早证明能引发肿瘤的病毒之一,属alpha反转录病毒属。根据与病毒的宿主特异性相关的囊膜蛋白gp85蛋白抗原性不同,ALV可分为A~J10个亚群,其中只有A、B、C、D、E和J亚群能感染鸡。自从1988年在英国的白羽肉鸡中发现了J-亚群ALV,就以极快的速度向全世界养鸡业蔓延,给全世界的养禽也带来巨大的损失,在过去十年中,我国对鸡群白血病的流行状况也有了大量报道。由于其造成损失比较严重,国际国内的养禽业也多把目光集中在了ALV-J上。近二年来,全国各地蛋鸡场在鸡群开产后发生白血病血管瘤的病例报告普遍显著上升,已成为影响我国蛋鸡业的第一大疫病,给广大农民养殖者带来很大经济损失。病毒分离鉴定表明,白血病/血管瘤主要是由J亚群禽白血病病毒引起,但也同时有的是由A、B亚群白血病病毒感染引起的。这不仅仅是蛋鸡的主要问题,这也是我国地方品系鸡的主要问题。由于经典的A、B、C、D亚群白血病在我国长期得不到关注且无任何净化措施,极有可能已经在地方品系鸡中广泛流行,甚至发生了新的变异产生了新的亚型。 本研究将山东某鸡场送检的地方培育品系种蛋孵化7~9d后,分别制备成鸡胚成纤维细胞(CEF)培养。在培养瓶中盲传3代后(共9 d),取细胞上清液用ALV-p27抗原检测试剂盒(IDEXX公司)检测,检测阳性的细胞上清接种DF1细胞。培养10d后再检测其上清中的p27,将ALV-p27仍是阳性的样品(共11份),分别胸肌注射接种42日龄SPF鸡,从第二周开始每两周翅静脉采血一次,分离血清,分别用ALV-J、ALV-ab抗体检测试剂盒检测,连测16周。同时采集泄殖腔棉拭子,用ALV-p27抗原ELISA检测试剂盒检测排毒情况。 结果显示有3份病毒接种的SPF鸡呈现一过性ALV-ab抗体阳性,只有一份病毒的接种鸡从第三周开始,出现了稳定的抗体,我们把这株病毒定名为SDAUE1A;ALV-J抗体检测试剂盒没有检测到阳性。结果表明,部分攻毒鸡有一过性排毒,大部分则没有检测到排毒,只有一份病毒是出现过一次抗体又有排毒现象的,我们把这株病毒定名为SDAUE2A株。另外有一株病毒在DF1培养时p27读数较高,但在动物试验阶段没有检测到抗体和排毒现象,我们定名为SDAUE2K。 以病毒感染的DF1细胞基因组DNA作为其前病毒基因组模板,参照国外发表的针对各亚型的引物序列合成引物, PCR扩增出其env基因的部分或全部序列,并分别连入T载体进行克隆、测序。然后利用DNAstar软件对测序结果进行剪辑和拼接,并将序列与GenBank中已发表的不同亚群ALV的env基因序列用DNAstar软件作同源性比较,根据同源性程度及系统进化树来确定分离株的亚群。本研究完成了对已定名的三株外源性病毒env基因的测序工作。 经基因组同源性分析并结合动物实验抗体检测结果,SDAUE1A与已发表的6株A亚群白血病病毒的氨基酸序列同源性最高(89.1%-90.9%),而与J亚群各参考株的同源性平均仅为38.4%(37.4-39.2%),因此SDAUE1A应该是一株A亚群ALV;SDAUE2K株与ALV的所有亚群基因组同源性都不是很高,与J亚群的3个毒株同源性仅为41.3%(38.3%-40.5%),我们暂时认为SDAUE2K株是一个新亚群;SDAUE2A株基因序列跟B亚群同源性最高(91.3%、90.7%),而与J亚群各参考株之间的同源性平均仅为40.3%(39.7~40.9%),动物实验也表明攻毒鸡呈一过性AB抗体阳性,所以应该是一株B亚群白血病病毒。


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