鸡白介素18成熟蛋白突变体在毕赤酵母中的高效表达及其生物活性检测
【摘要】：
鸡白介素18(Chicken interleukin-18, ChIL-18)是新发现的一种细胞因子,它具有广泛的生物活性,除能够促进γ-干扰素(IFN-γ)的产生,刺激淋巴细胞转化,增强NK细胞的杀伤活性,还在介导细胞免疫、抵抗微生物感染方面具有重要的作用。毕赤酵母表达系统是目前最为成功的外源蛋白表达系统之一,该系统操控简单、经济,表达量高,具有翻译后修饰的能力。目前已有多种外源蛋白在毕赤酵母表达系统中得到成功表达。因此可用毕赤酵母表达获得高产量且具有生物活性的鸡白介素18成熟蛋白(mature Chicken interleukin-18, mChIL-18)。本试验首先通过引物设计来定点突变鸡白介素18基因,构建成功能分泌表达鸡白介素18成熟蛋白的重组表达质粒pPIC9K-mChIL-18,然后将其导入毕赤酵母GS115中。筛选多拷贝阳性子,表达mChIL-18蛋白,测定其生物活性,为mChIL-18进一步的研究与开发打下基础。本研究的主要结果如下:
为了得到高表达量的mChIL-18蛋白,根据毕赤酵母密码子偏嗜性,通过引物设计来定点突变鸡白介素18基因。同时构建了重组质粒pPIC9K-mChIL-18。经PCR和酶切鉴定、DNA测序得知:mChIL-18基因表达片段定向插入到表达载体启动子下并形成正确的开放阅读框(ORF)。
用Sal I酶切重组质粒pPIC9K-mChIL-18,采用电转仪将其电转到毕赤酵母GS115中,经G418筛选出多拷贝阳性子。在提取染色体DNA之后,用特异性引物和通用引物对转化菌株进行PCR鉴定,结果显示扩增出了特异条带,表明外源基因整合进了宿主细胞染色体中。将筛选的多拷贝重组菌用甲醇诱导表达蛋白。经优化表达条件,证明在诱导温度为28℃,培养液pH值为6.5,甲醇的诱导浓度为2%,诱导时间为120 h时表达量最高,表达量约为480 mg/L。
用MTT法和微量细胞病变抑制法检测mChIL-18蛋白的生物活性。表达的mChIL-18蛋白能够刺激SPF鸡淋巴细胞大量增殖,用400 ng/mL的mChIL-18诱导淋巴细胞产生γ-干扰素(IFN-γ),其生物活性最高可达1.7×104 U/mL,且能有效抑制水泡性口炎病毒(VSV)在鸡胚成纤维细胞(CEF)上的生长。
由试验结果得知:通过定点突变基因、优化表达条件等方法,用毕赤酵母能够高效表达具有生物活性的鸡白介素18,因此有望作为免疫佐剂运用到工业化生产和兽医临床中。
【关键词】：鸡白介素18 毕赤酵母 突变体 生物活性 【学位授予单位】：山东农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2010
【分类号】：S852.4
【目录】：
- 中文摘要8-10
- 英文摘要10-12
- 1 引言12-34
- 1.1 细胞因子的研究进展12-14
- 1.2 白细胞介素18 的研究进展14-23
- 1.2.1 IL-18 的分子结构14-15
- 1.2.2 IL-18 的处理机制15-16
- 1.2.3 IL-18 的受体和信号转导16
- 1.2.4 IL-18 的生物学功能16-21
- 1.2.5 IL-18 的检测21-22
- 1.2.6 IL-18 与变态反应性疾病22
- 1.2.7 IL-18 与自身免疫疾病22-23
- 1.2.8 IL-18 引起内毒素诱导的肝损伤23
- 1.3 鸡白细胞介素18 的研究进展23-25
- 1.4 毕赤酵母的研究进展25-32
- 1.4.1 毕赤酵母表达系统的特性25-26
- 1.4.2 毕赤酵母菌株26
- 1.4.3 毕赤酵母表达载体26-27
- 1.4.4 巴斯德毕赤酵母表达系统的转化方式27-28
- 1.4.5 外源蛋白在毕赤酵母中的表达机理28-30
- 1.4.6 外源蛋白的表达30-32
- 1.5 本研究的目的及意义32-34
- 2 材料与方法34-57
- 2.1 材料34-40
- 2.1.1 菌株、载体、引物、病毒及细胞34
- 2.1.2 各种酶和试剂34-36
- 2.1.3 实验相关溶液的配制36-39
- 2.1.4 仪器与设备39-40
- 2.2 方法40-57
- 2.2.1 定点突变鸡白介素18 基因40-41
- 2.2.2 pPIC9K-mChIL-18 重组真核表达质粒的构建41-47
- 2.2.3 线性化 pPIC9K-mChIL-18 重组质粒、GS115 酵母感受态的 制备及电转化47-49
- 2.2.4 毕赤酵母转化子表型鉴定49
- 2.2.5 多拷贝重组菌株的筛选及PCR 法鉴定重组菌株49-51
- 2.2.6 阳性转化子的诱导表达及最佳诱导表达条件的探索51-52
- 2.2.7 表达蛋白SDS-PAGE、测定蛋白含量及Western blot 分析52-55
- 2.2.8 mChIL-18 蛋白促进鸡脾淋巴细胞增殖试验55
- 2.2.9 m ChIL-18 蛋白及其诱导产生的IFN-γ对VSV 的抑制活性试验55-57
- 3 结果与分析57-67
- 3.1 mChIL-18 酵母表达载体的鉴定57-59
- 3.1.1 mChIL-18 酵母表达载体的PCR 鉴定57
- 3.1.2 mChIL-18 酵母表达载体的酶切鉴定57-58
- 3.1.3 mChIL-18 酵母表达载体的序列测定58-59
- 3.2 筛选毕赤酵母转化子的His+/Mut+表型59
- 3.3 GS115/pPIC9K-mChIL-18 多拷贝重组菌株的筛选鉴定59-61
- 3.4 表达产物的SDS-PAGE 分析61-62
- 3.5 Bradford 法测定表达上清中mChIL-18 蛋白含量62-63
- 3.6 表达产物的Western blot 分析63-64
- 3.7 mChIL-18 蛋白促进鸡脾淋巴细胞增殖试验64-65
- 3.8 mChIL-18 蛋白及其诱导产生的IFN-γ对VSV 的抑制活性试验65-67
- 4 讨论67-72
- 4.1 鸡白介素18 成熟蛋白基因的定点突变及重组表达质粒pPIC9K-mChIL-18 的构建67-68
- 4.2 鸡白介素18 成熟蛋白突变体在毕赤酵母中的高效表达68-70
- 4.3 鸡白介素18 成熟蛋白的生物活性检测70-72
- 结论72-73
- 参考文献73-84
- 致谢84-85
- 攻读学位期间发表论文情况85
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