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《山东农业大学》 2011年
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玉米纹枯病菌内切多聚半乳糖醛酸酶基因的克隆表达及致病性分析

韩爽  
【摘要】:玉米纹枯病是世界上玉米产区广泛发生、危害严重的世界性病害之一,并且已成为我国玉米产区的主要病害,其主要病原菌为立枯丝核菌(Rhizoctonia solani Kühn),在活体上可以产生多种胞壁降解酶,以多聚半乳糖醛酸酶(PG)、聚甲基半乳糖醛酸酶(PMG)和纤维素酶为主。果胶质广泛存在于高等植物中,是植物细胞间质和初生细胞壁的重要组分,与纤维素、半纤维素一起构成一个阻挡外界的坚韧屏障,在植物细胞组织中起着“黏合”作用。果胶酶是植物病原物最重要的致病因子之一,是植物病原物破坏植物细胞壁的主要细胞壁降解酶之一。 本研究以立枯丝核菌(Rhizoctonia solani Kühn)AG1-IA为研究对象,根据真菌内切多聚半乳糖醛酸酶的同源保守序列设计兼并引物,通过RT-PCR、快速扩增cDNA末端(RACE)及TAIL-PCR的方法克隆了三种内切多聚半乳糖醛酸酶基因。其中pg1全长cDNA为1086bp,包含一个由344个氨基酸组成的开放阅读框。该基因已在GenBank中注册,登录号为HQ413152。pg2 DNA全长1414bp,包含六个内含子区域,登录号为HQ156225;全长cDNA为1086bp,共编码344个氨基酸,登录号为HQ156226。pg3 DNA全长1195bp,包含五个内含子区域,登录号为HQ413151;cDNA全长为927bp,包含一个由309个氨基酸组成的开放阅读框,登录号为HQ413150。序列比对分析表明,三个蛋白均属于糖苷水解酶28家族。 构建了毕赤酵母重组表达载体pPIC9K/pg1、pPIC9K/pg2和pPIC9K/pg3。将重组表达质粒pPIC9K/pg1和pPIC9K/pg3转化毕赤酵母GS115,获得了转酵母工程菌株GS-PG1-4和GS-PG3-18并进行纯化,纯化后的酶液接种玉米叶片,24h后出现水浸状病斑,72h之后变为枯斑,接失活酶液的对照叶片无症状,这表明立枯丝核菌(R. solani Kühn)AG1-IA多聚半乳糖醛酸酶基因pg1和pg3中可能是玉米纹枯病的致病基因。将立枯丝核菌(R. solani Kühn)AG1-IA接种到玉米叶片上,24h产生暗绿色水渍状病斑,之后病斑中央灰褐色,边缘变为深褐色。用三条基因的三对特异引物分别进行扩增,结果1-7天都出现目的条带,说明内切多聚半乳糖醛酸酶基因参与玉米纹枯病的致病过程。立枯丝核菌(R. solani Kühn)AG1-IA分别在以果胶和葡萄糖为底物的培养基上生长,结果发现内切多聚半乳糖醛酸酶三条基因在果胶培养基上培养的菌丝中1-7天都表达,在葡萄糖培养基生长的菌丝中不表达,说明内切多聚半乳糖醛酸酶具有强烈的底物特异性。
【学位授予单位】:山东农业大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2011
【分类号】:S435.131

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【引证文献】
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