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《山东农业大学》 2011年
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棉花RNA依赖的RNA聚合酶6(GhRDR6)基因的分离及功能分析

王冕  
【摘要】:植物RNA依赖的RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase,RDR)最早在中国卷心菜中发现,后从多种植物中分离出来。研究发现,RDR以细胞或病毒RNA为模板合成短的cRNA,参与序列特异的dsRNA诱导的基因沉默及抗病毒途径。在拟南芥中RDR有6个同源基因:RDR1、RDR2、RDR3a、RDR3b、RDR3c、RDR6。本文以重要的经济作物棉花(Gossypium hirsutum L. cv. Lumian 22)为实验材料,首次从棉花中克隆得到RDR6基因,并进行了序列比对、表达特异性分析、超表达转基因抗病毒分析及生长发育等相关鉴定,为进一步明确RDR6的功能及作用机理奠定了理论基础。主要的研究结果如下: (1)利用RT-PCR和RACE-PCR的方法,从棉花中克隆得到一个RDR基因,并命名为GhRDR6(GenBanK注册号:GQ254649)。该基因全长4183bp,包括3591bp的开放阅读框(ORF),331bp的5′非编码区(5′UTR)和261bp的3′非编码区(3′UTR),编码一条含有1196个氨基酸的多肽,预测分子量为138.225kDa。同源序列分析发现,GhRDR6含有全部的RDR家族的功能区,并存在典型的保守基序DbDGD(b代表任一残基),它是二价阳离子结合并产生催化活性的位点。进一步分析发现GhRDR6与拟南芥AtRDR6,普通烟NtRDR6和水稻OsRDR6同源性较高,分别达到了66%,66%和56%,而与棉花RDR1的同源性仅仅31%。cDNA序列与基因组(GenBank注册号:GQ254651)序列比对发现,该基因中含有两个内含子,其中一个位于5′UTR中。Southern blot实验证明该基因在棉花基因组中以单拷贝形式存在。 (2)利用半定量RT-PCR的方法,研究了GhRDR6基因在不同表达部位及多种非生物胁迫下的mRNA水平的表达特异性。结果表明,GhRDR6基因在根系中的表达量要明显高于在茎、叶中的表达,推测可能参与根系的生长。在水杨酸(SA)、过氧化氢(H2O2)和6-苄氨基嘌呤(6-BA)诱导下,该基因表达量没有明显变化,但是在赤霉素(GA)、茉莉酸(JA)、乙烯(5mM乙烯利,ET)、萘乙酸(NAA)、茉莉酸甲酯(MeJA)、脱落酸(ABA)、盐、冷和伤等处理下mRNA水平表达量较高。推测该基因可能参与多种激素诱导途径。 (3)将GhRDR6 cDNA序列连入表达pBI121,构建正义表达载体,采用农杆菌介导的方法,转化本生烟(Nicotiana benthamiana),同时转化空载体为对照。经卡那霉素筛选获得若干植株。经PCR和Northern blot分析,证明该基因在转基因烟草中成功表达。选取两个鉴定好的T0代转基因植株进行自交繁育,得到T1代,对T1代进行遗传分析,发现两个株系均符合3:1的分离规律。继续进行自交繁育,得到T2代转基因植株,进行Northern bolt实验,证明棉花RDR6基因成功表达。 (4)转基因植株根的相对生长情况发现,转基因植株在3周时比野生型植株根相对增长1-2cm,但是6周时这种区别不明显了。在经过ABA处理后转基因植株根相对增长2-2.5cm;在JA、MeJA和GA处理后转基因植株的根较野生型分别增长1-1.5cm和1.5-2cm,而在经过6-BA、NAA、NaCl、甘露醇(Mannitol)和PEG处理后,转基因植株根没有明显变化。对转基因种子的萌发率实验中,发现它与野生型植株并没有明显的区别。 (5)抗病毒实验中,接种PVY病毒后,转基因植株对PVY病毒表现出明显的抗性。DAB染色分析发现,转基因植株中H2O2的积累量明显低于野生型。半定量RT-PCR分析两种植株中病毒CP基因表达量发现,转基因植株中CP基因表达量明显低于野生型,而且转基因植株中NPR1基因的表达量高于野生型。在转基因抗病中还发现Osmotin基因在转基因植株中表达量增加,而PR4基因表达量下降,但是NbACOI和NbPR1a基因表达量没有明显变化。 (6)转基因植株的抗逆境胁迫研究发现,超表达GhRDR6转基因植株的抗冻性增强,而且在经过7d的恢复生长后相对存活率明显高于野生型,相对新生叶片的数量也较野生型增加。转基因植株对于盐和干旱的抗性与野生型植株没有明显区别。
【学位授予单位】:山东农业大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2011
【分类号】:S562

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【参考文献】
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