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《山东农业大学》 2011年
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REV重组env蛋白间接ELISA诊断试剂盒的研制与应用

李彦  
【摘要】:禽网状内皮组织增殖病(Reticuloendotheliosis , RE)是由禽网状内皮组织增殖病病毒(REV)引起的鸡、火鸡、鸭、鹤鹑和鹅等以淋巴网状细胞增生为特征的肿瘤性疾病。尽管REV本身对禽的致死作用并不很明显,但由于REV能使法氏囊萎缩,其致病基因V-rel能引起B淋巴细胞转化为肿瘤细胞,侵损禽机体免疫系统,使机体抵抗力下降,从而导致其它疾病的并发感染,造成高淘汰率和高死亡率。因此,建立能普查REV的方法十分必要。 本研究采用分子生物学方法,在对REV的env基因克隆、原核表达的基础上,以纯化的GST-env囊膜蛋白为包被抗原,替代REV全病毒,建立了检测REV抗体的间接ELISA方法(ienv-ELISA),并组装成试剂盒。用该ienv-ELISA诊断试剂盒与进口的全病毒ELISA(iREV-ELISA)诊断试剂盒进行对比,探讨了准确率。从而为我国养禽业提供了特异、灵敏、安全、快速、价廉的国产REV抗体检测试剂盒。首先,本实验以IPTG诱导PGEX-4T-3-env/BL21基因工程菌,进行原核表达,并用SDS-PAGE检测,与空白破碎菌体对照结果显示破碎菌体蛋白在69.38KD处出现1条明显的特异性条带,表明env基因在大肠杆菌中以包涵体的形式进行了高效表达。将PGEX-4T-3-env/BL21基因工程菌以IPTG进行大量诱导,使其表达env囊膜蛋白,然后在冰浴条件下超声波破碎,用8mol/L尿素溶解液洗涤并溶解包涵体蛋白,4℃尿素梯度复性后用GST融合蛋白纯化试剂盒纯化,经测定纯化目的蛋白待测样品中GST-env囊膜蛋白的含量为391.98μg/mL。将纯化得到的GST-env囊膜蛋白进行Western blot检测分析,结果表明,该GST-env囊膜蛋白具有良好的抗原性和反应原性,能够很好地识别REV抗体。 以纯化的GST-env囊膜蛋白为包被抗原,建立了检测REV抗体的间接ELISA(ienv-ELISA)方法。对ienv-ELISA工作条件优化进行优化,结果表明,最佳抗原包被液为CB;最佳封闭液浓度为1% BSA-PBST;最佳抗原包被量为8μg/mL;血清最佳稀释度为1:300;血清最佳作用时间为1 h;二抗的最佳稀释度为1:5000;二抗最佳作用时间为1 h;底物最佳显色时间为25 min。重复性试验、特异性试验、对比试验和保存期实验结果显示,建立的ienv-ELISA方法有良好的可重复性,标准差均小于15%;与鸡MDV、ALV、NDV、H5N1、H9N1等病毒阳性抗体均无交叉反应;与REV抗体检测试剂盒(iREV-ELISA)对比,所建立的ienv-ELISA诊断敏感性、诊断特异性以及准确率分别为90.625%、93.75%和92.7%,表明该方法具有良好的重复性、反应特异性、诊断敏感性、诊断特异性、准确率和耐储存性。 用组装的试剂盒对采集自山东部分地区养殖场的鸡群的235份血清进行了REV抗体的检测,结果发现其中阳性血清77份,阴性血清158份,阳性率为32.77%,与iREV-ELISA对比,准确率为90.2%。
【学位授予单位】:山东农业大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2011
【分类号】:S855.3

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