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J亚群禽白血病病毒和禽网状内皮组织增生症病毒单克隆抗体的研制

王峰  
【摘要】:禽白血病和网状内皮组织增生症均可引起禽类肿瘤和免疫抑制性疾病。这两种禽肿瘤病都可导致不同程度的二重感染、多重感染及继发感染,减弱鸡群对各种疫苗的应答能力,加剧某些疾病的临床表现。目前,对禽白血病和禽网状内皮组织增生症尚无有效的药物治疗,也没有疫苗可以进行预防,世界各国主要通过抗原/抗体检测,淘汰阳性鸡,净化种群等防制措施来控制这两种禽肿瘤病。 ALV-J gp85基因编码的表面蛋白(SU)是病毒囊膜蛋白的重要组成成分,有许多病毒抗原位点,也是亚群区分的主要蛋白,是检测亚群特异性抗体的首选抗原。REV env基因编码SU和跨膜蛋白(TM)。本课题分别以ALV-J中国株WS0705和REV原型株SNV株为标准株,选取了1200bp相对保守的env基因序列,包涵该段基因表达REV病毒90%以上的抗原位点,既保证了基因的保守性又保留了良好的抗原性。本将含有ALV-J gp85基因重组质粒pProExHTB-gp85转化入BL21宿主菌,将含有REV env基因的重组质粒pET-28a-env转化入BL21(DE3)宿主菌,分别优化诱导表达条件,诱导表达产物经SDS-PAGE电泳,分别在在35KD处和45KD处出现目的蛋白。采用尿素法纯化大量表达的蛋白包涵体,通过透析法恢复蛋白的天然构象和蛋白活性。测定纯化蛋白浓度后进行ELISA和Western-blot检测,结果显示ELISA检测灵敏性能达到100ng/mL,表达的两种蛋白都具有良好的灵敏性和特异性。 以纯化的His-gp85蛋白和His-env蛋白为抗原免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体,免疫剂量为300μg/只,免疫3次采后通过ELISA和IFA试验测定了所获得的多抗效价,ELISA测得效价分别达到1:100万和1:200万,IFA测得效价分别高于1:3200和1:12800。 以纯化的His-gp85蛋白和His-env蛋白为抗原免疫6周龄的Balb/c纯系小鼠,40μg/只,免疫3次,采血,建立间接ELISA方法和IFA法测定血清抗体效价。取血清效价高的Balb/c小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞在PEG1500的作用下进行细胞融合。用HAT选择培养基对杂交瘤细胞进行培养,当杂交瘤细胞集落布满孔底1/4 - 1/2时,取细胞上清作抗体效价检测。采用有限稀释法对阳性孔进行亚克隆,重复3次以上,直到取得能稳定分泌抗体的单克隆细胞株。得到抗ALV-J病毒单克隆细胞两株分别命名为1D3和3B1,ELISA检测细胞上清抗体效价均为1:1024;得到抗REV病毒单克隆细胞株一株命名为4D5,ELISA检测细胞上清效价为1:2048,并进行腹水制备,并通过ELISA和IFA试验测定了所获得的单抗腹水的效价,ELISA效价为1:40万,IFA效价为1:6400;腹水又经SDS-PAGE、Western-blot等法的综合检测表明所得单抗具有良好的特异性。 本研究的完成为制备ALV-J和REV抗体/抗原ELISA检测试剂盒的国产化奠定了基础;为快速、准确诊断两种禽肿瘤病、保障我国禽业的健康持续发展提供技术支持。


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