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《山东农业大学》 2011年
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叶籽银杏EFRO发育过程中DNA甲基化修饰机理及系统学意义

李际红  
【摘要】:银杏(Ginkgo biloba L)有许多原始和进化特征。银杏属实际上可能是现存的种子植物中最古老的一个属。国内外大量研究表明银杏是比较形态学、解剖学、胚胎发育及系统发育研究的最理想的试材之一。 叶籽银杏(Ginkgo biloba var. epiphylla Mak.)作为银杏家族中的一个特异种质,具有重要的理论和观赏价值。其最大特点在于叶生雌性生殖器官(epiphyllous female reproductive organ,EFRO)的个体发生和结构。它们对银杏的系统发育、起源、演化及亲缘关系的研究具有重要意义。本研究通过对叶籽银杏叶生雌性生殖器官(EFRO)发育与再生过程中DNA甲基化分子机制的研究,以期揭示叶籽银杏雌性生殖器官的形态学本质及其系统学意义。其实验结果和主要结论如下: 本研究采用甲基化敏感扩增多态性技术(MSAP),以叶籽银杏、银杏及攀枝花苏铁、铁线蕨两个外类群为材料,从54对MSAP选扩增引物中,选出扩增清晰、可辨且可重复的16-24对MSAP引物组合,扩增获得这四个物种的DNA胞嘧啶甲基化修饰水平及MSAP扩增图谱,结果表明叶籽银杏基因组中至少有48.7%(全甲基化34%、半甲基化14.7%)、银杏44.0%(全甲基化32.8%、半甲基化11.2%)、苏铁39.6%(全甲基化29.2%、半甲基化9.8%)、铁线蕨44.6%(全甲基化29.4%、半甲基化15.2%)的CCGG/GGCC位点发生胞嘧啶甲基化。与相关物种比较,这四个物种的DNA胞嘧啶甲基化水平整体较高。植物基因组DNA胞嘧啶甲基化修饰检出率不同,反映了在基因组水平上的物种的差异性。 本研究通过对叶籽银杏、银杏在萌动期和展叶期的CCGG/GGCC位点胞嘧啶甲基化进行的总体分析,结果发现萌动期叶籽银杏甲基化水平47.6%、银杏42.4%,展叶期叶籽银杏着生叶生胚珠的叶籽银杏(YZ)甲基化水平48.3%、没有着生叶生胚珠的叶籽银杏(YC)40.5%、银杏(CK)41.5%,体现为叶籽银杏的甲基化高于YC及CK;同时叶籽银杏、银杏在甲基化模式上存在着丰富的差异,萌动期叶籽银杏相对于银杏去甲基化比例为13.2%,超甲基化比例为14.6%,超甲基化的比例略高于去甲基化;展叶期YZ相对于YC去甲基化比例为8.2%,超甲基化比例为16.0%,YZ相对于CK去甲基化比例为4.8%,超甲基化比例为28%,总体表现为展叶期的YZ相对于YC及CK的超甲基化水平高于萌动期的超甲基化水平。显示萌动期与展叶期叶籽银杏甲基化修饰的水平不同。说明叶籽银杏EFRO发育过程中胞嘧啶甲基化具有时空特异性。 本研究对叶籽银杏不同组织DNA胞嘧啶甲基化的水平、模式及模式上的差异类型进行分析,结果发现叶籽银杏不同组织DNA胞嘧啶甲基化的水平不同,其发端期47.7%、雌配子发育前期(前期)46.0%、雌配子发育中期(中期)45.2%、雌配子发育后期(后期)41.8%、叶籽银杏正常胚珠胚乳初期(CK)35.3%。不同组织在甲基化模式上也存在着广泛的差异,表现为发端期相应于前期去甲基化比例为19.7%、超甲基化比例为14.6%,中期去甲基化比例20.0%、超甲基化比例为13.30%,后期去甲基化比例为20.3%、超甲基化比例为14.6%,CK去甲基化比例为20.3%,超甲基化比例为18.8%。不同组织甲基化模式上的差异体现为发端期组织相对于雌配子发育的三个时期的组织(前期、中期、后期)及叶籽银杏正常胚珠胚乳初期组织(CK)的去甲基化水平高于超甲基化水平,发生了去甲基化,这个时期有更多的基因表达,是叶籽银杏EFRO形成的关键时期。叶籽银杏在不同时期、不同组织这种去甲基化/超甲基化的变化式样,对揭示叶籽银杏EFRO形成的可能机制及系统学意义奠定了基础。 本研究从54对MSAP选扩引物中,选出16对MSAP选扩引物组合,扩增产生叶籽银杏不同单株清晰可辨的MSAP扩增图谱,检测其甲基化水平,发现不同单株甲基化水平不同,其中,沂源油坊(I油坊)为47.2%、沂源织女洞南(I织南) 44.09%、沂源织女洞北(I织北) 43.8%、沂源白裕(I白裕) 43.3%、沂源中河(I中河) 43.5%、泰安老君堂正常银杏(CK)39.7%。不同单株在甲基化模式上也存在着广泛的差异, I油坊相对于I织南、I织北、CK的去甲基化比例分别为8.7%、13.3%和8.42%,超甲基化比例分别为27.1%、11.22%、13.68%。在同一时期,I油坊较之其他几株表现为较高的超甲基化水平,或许与I油坊树龄大(树龄为1300年,其余在700年左右)有关。即植物形态的构成与年龄有一定的关联。 本研究采用分子生物学技术,对部分叶籽银杏、银杏修饰位点及叶籽银杏多态性位点进行克隆和序列分析,通过匹配的同源序列功能注释,发现叶籽银杏、银杏基因组中包括大量的重复序列、转座子序列、转录调控因子、反转录转座子序列、F-box蛋白、叶绿体通道蛋白、钠离子通道蛋白、泛素蛋白、假设蛋白及乙酸脱氢酶在内的多种类型DNA序列中均存在DNA甲基化修饰现象。这些基因在叶籽银杏和银杏中的甲基化状态被修饰的程度不同,表明它们可能有助于叶籽银杏和银杏间的表型差异的形成,对于解读叶籽银杏的形成机制具有一定的意义。
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