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《山东农业大学》 2011年
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不同途径免疫NDV弱毒苗诱导鸡体黏膜和系统免疫反应的研究

闫振贵  
【摘要】:鸡新城疫(Newcastle disease,ND)是由新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)引起的一种急性、败血性、高度接触性传染病,是危害世界养禽业的最重要传染病之一。目前,预防ND虽然有多种有效疫苗,但由于免疫途径和免疫方法不当等原因,致使鸡群发生ND的现象不断发生,对养鸡业的健康发展造成了很大的损失。一般认为系统免疫在鸡抵抗NDV的感染中发挥主要作用,但在生产实践中却存在着鸡体血清抗体水平高仍然发病的现象,原因何在?有待探索。黏膜免疫是鸡体免疫系统产生免疫应答的重要组成部分,对鸡体的局部免疫及全身免疫发挥着重要作用。长期以来,关于NDV弱毒疫苗免疫的研究主要集中于全身系统免疫,而对特异性黏膜免疫的发生规律的研究较少,难以全面揭示NDV弱毒疫苗的免疫保护机理。因此,本研究对NDV弱毒苗经不同黏膜途径免疫雏鸡后呼吸道和消化道等局部黏膜特异性抗体和抗体阳性细胞的的发 生规律进行了全面系统的研究,主要试验结果如下: 1.鸡SIgA的纯化及其抗病毒活性 首先应用硫酸铵盐析和聚乙二醇(PEG)沉淀粗提鸡胆汁中的分泌型IgA(SIgA),再经Sephadex G-200凝胶过滤和DEAE纤维素离子交换层析纯化SIgA,并用SDS-PAGE电泳和琼脂扩散试验检测其纯度和活性,然后采用鸡胚接种试验、鸡胚病毒中和试验和攻毒治疗试验,检测鸡SIgA的抗NDV活性,结果表明,纯化的鸡SIgA终浓度为3.8mg/mL,重链分子量约为67kD,轻链分子量约为28kD;SIgA处理NDV后,能明显降低鸡胚尿囊液中NDV的血凝效价,与血清组差异不显著(P0.05);鸡SIgA的鸡胚病毒中和指数为6.2,低于免疫血清;另外,用纯化的SIgA治疗攻毒的SPF鸡,其治愈率为46.7%,同样与血清治疗组差异不显著(P0.05);试验结果证明鸡SIgA具有一定的中和NDV的能力。 2.不同途径免疫NDV弱毒苗诱导鸡体黏膜和系统免疫发生规律的研究 通过建立了检测NDV特异性抗体的间接ELISA方法,对7日龄SPF鸡经不同途径免疫NDV弱毒苗后的血清、胆汁、呼吸道和消化道分泌液中NDV特异性SIgA、IgG和IgM的消长规律进行了检测,同时检测了血清HI抗体滴度。结果表明,点眼滴鼻免疫和饮水免疫鸡的血清、胆汁、呼吸道和消化道分泌液中均可检测到NDV特异性SIgA、IgG和IgM,其中:IgM在所有样品中检出时间最早,大部分于免疫后第3d检测到,并于第7d达到高峰后迅速下降,是鸡体早期抵抗NDV感染的主要抗体;IgG大部分于免疫后第7d检测到,并于第21d达到高峰,是血清的优势抗体;SIgA大部分于免疫后第7d检测到,并于第28d达到高峰,在胆汁、呼吸道和消化道分泌液中抗体水平最高,且维持时间最长,是NDV弱毒苗诱导鸡胆汁、呼吸道和消化道分泌液中抗NDV的主要抗体。各组免疫鸡不仅在诱导部位黏膜分泌液中产生高水平的特异性SIgA、IgG和IgM,而且在远端黏膜也产生抗体,表明鸡的黏膜免疫类似哺乳动物,也具有共同黏膜免疫的特点。点眼滴鼻免疫诱导的血清HI抗体滴度和特异性SIgA、IgG和IgM抗体水平显著高于饮水免疫,表明点眼滴鼻免疫诱导的系统体液免疫强于饮水免疫。点眼滴鼻免疫在气管洗液和肺洗液诱导产生的特异性SIgA水平显著高于饮水免疫,而饮水免疫在消化道洗液中诱导的特异性SIgA水平又显著高于点眼滴鼻免疫,表明不同免疫途径在各黏膜效应位点诱导的黏膜免疫反应的强度不同,点眼滴鼻免疫在呼吸道引起的黏膜免疫要强于饮水免疫,而饮水免疫在消化道的免疫强度要高于点眼滴鼻免疫。 3.不同途径免疫NDV弱毒苗诱导鸡体黏膜和免疫器官中IgA、IgM和IgG阳性细胞变化规律的研究 采用常规石蜡切片技术,优化了各种反应条件,建立了检测免疫器官和局部黏膜IgA、IgM和IgG阳性细胞的间接免疫过氧化物酶组织化学染色法。应用该法,对7日龄经不同途径免疫NDV弱毒苗的SPF鸡脾脏、气管、十二指肠、空肠、回肠、盲肠扁桃体和直肠中的IgA、IgM和IgG阳性细胞的分布规律和增殖规律进行分析。结果显示,IgA、IgM和IgG阳性细胞呈圆形或卵圆形,被染成深棕黄色,在脾脏中主要分布在边缘区及红髓的髓索中,在气管中主要分布在气管粘膜固有膜内和气管腺之间,在肠管中主要分布在肠绒毛固有层内和肠腺之间。饮水和点眼滴鼻免疫均能诱导鸡脾脏、呼吸道和消化道中产生IgA、IgM和IgG阳性细胞,其中脾脏中IgG阳性细胞数量最多,呼吸道和消化道黏膜中IgA阳性细胞数量最多。在免疫后的第21和28d,肠道黏膜固有层中IgA阳性细胞数量显著多于IgM和IgG阳性细胞。在免疫后第21-28d,点眼滴鼻免疫诱导的脾脏中IgG阳性细胞数量多于饮水免疫,但差异不显著(P0.05),而饮水免疫诱导的十二指肠、空肠、回肠和直肠黏膜中IgA阳性细胞数量多于点眼滴鼻免疫,但差异不显著(P0.05)。 4.免疫抑制对NDV弱毒苗诱导的鸡体黏膜免疫反应的影响 通过摘除法氏囊和注射环磷酰胺(CY)两种方法造成1日龄SPF鸡的免疫抑制,7日龄时用NDV弱毒苗经饮水免疫试验鸡,于免疫后不同时期检测各组鸡免疫器官相对重量,外周血淋巴细胞数量,血清HI抗体滴度,胆汁、气管洗液、十二指肠洗液中NDV特异性SIgA水平以及小肠黏膜固有层中IgA阳性细胞的数量,比较两种免疫抑制方法对系统免疫和黏膜免疫的影响。结果表明,两种方法均能显著降低血清HI抗体滴度,引起严重的系统体液免疫抑制,其中CY的抑制作用更强;两种方法亦能显著降低胆汁、气管洗液和十二指肠洗液中NDV特异性SIgA抗体水平和小肠黏膜固有层中IgA阳性细胞的数量,特别在免疫后前3周以内抑制作用最明显,从而也引起较严重的局部黏膜免疫反应抑制;另外,NDV强毒攻毒试验表明局部黏膜免疫在抵抗NDV感染中发挥了一定的保护作用。 5.免疫增强剂对NDV弱毒苗诱导的鸡体黏膜免疫反应的影响 将NDV弱毒苗分别与CpG ODN、黄芪多糖(APS)、左旋咪唑(LMS)混合,并经点眼滴鼻免疫14日龄雏鸡,通过检测免疫后各组鸡的血清HI抗体滴度、局部分泌液中的特异性SIgA抗体水平,评价3种免疫增强剂对NDV弱毒苗引起的黏膜和系统体液免疫反应的增强作用。结果表明,在免疫后第3、4周,3种免疫增强剂均能提高血清HI抗体滴度,其中LMS的免疫增强作用强于CpG ODN和APS;3种免疫增强剂亦均能提高气管洗液、十二指肠洗液、胆汁中NDV特异性SIgA抗体水平,其中CpG ODN序列的免疫增强作用强于APS和LMS;以上试验结果充分证明了3种免疫增强剂不仅能增强NDV弱毒苗引起的系统体液免疫应答,而且也能较显著增强黏膜免疫应答反应。 综上所述,本研究从鸡的局部体液IgG、IgM和SIgA抗体水平的消长规律、局部黏膜组织IgM、IgG和IgA抗体阳性细胞增殖规律,揭示了NDV弱毒苗经不同黏膜途径免疫鸡后各黏膜部位的黏膜反应特点及差异性,为深入研究鸡的黏膜免疫反应特点和ND的疫苗防疫提供了重要的理论依据和技术支持,对ND的科学防制具有重要的理论意义和现实意义。
【学位授予单位】:山东农业大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2011
【分类号】:S858.31

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