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《山东农业大学》 2011年
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mChIL-18基因与IBDV VP2基因或AIV HA1基因在pFastBac~(TM) Dual中的共表达及其免疫原性研究

孔娜  
【摘要】:白细胞介素18(Interleukine-18, IL-18)是一种多效细胞因子,具有强烈的IFN-γ诱生能力,对机体起着重要的免疫调节和保护作用,在抗微生物感染、抗肿瘤免疫中具有应用潜力,因此IL-18可作为免疫佐剂与一些病原微生物的保护性基因共表达,从而加强疫苗的免疫效果或制备基因工程疫苗;由于鸡IL-18(ChIL-18)基因发现得比较晚,而对人和哺乳动物IL-18的研究已有许多报道,且其具有与人和哺乳动物相似的生物学功能,因此ChIL-18在比较免疫学研究和禽病治疗中具有重要意义。pFastBac~(TM) Dual载体含有PH启动子和p10启动子,可以同时表达两个具有独立活性的外源蛋白。His标签的引入为重组蛋白的纯化提供可能,为获得大量有生物活性的蛋白开辟了新途径。 传染性法氏囊病(Infectious bursal disease, IBD)是由IBD病毒(IBDV)感染雏鸡引起的以淋巴组织,特别是中枢免疫器官-法氏囊为主要特征的高度接触性传染病。该病主要导致机体免疫抑制,使机体的免疫能力降低和疫苗免疫接种失败。虽然灭活疫苗和减毒活疫苗是相当成熟的,但由于IBDV强毒株和抗原变异的出现使其免疫效价降低。VP2是IBDV的主要保护性抗原,已经鉴定的IBDV中和表位主要在VP2上,并且多为构象依赖性,这意味着VP2的立体结构对其中和表位的形成至关重要,与病毒中和抗体的诱导、抗原和毒力的变异以及细胞凋亡的诱导等有关。 禽流感(Avian influenza, AI)是由AI病毒(AIV)感染引起的一种高度接触性人畜共患传染病。HPAI的暴发给养禽业带来了一定的经济损失,H5N1亚型AI的出现不仅产生经济损失,还带来了恐慌。AIV的主要抗原决定簇都位于HA1区域。体外表达HA1涵盖了所有的HA空间中和表位,故其完全可以替代HA作为抗原。所以HA1蛋白是研制基因工程亚单位苗的理想候选抗原。 本试验分别以pMD18-T-VP2、pMD18-T-HA1和pMD18-T-mChIL18质粒为模板,以杆状病毒pFastBac~(TM) Dual为载体,将mChIL18基因与VP2基因或HA1基因分别插入到载体的PH启动子和P10启动子的下游,构建重组转移载体质粒pF-IL18、pF-VP2、pF-IL18-VP2、pF-HA1、pF-IL18-HA1。将其转化DH10Bac感受态细胞,经三重抗性(含卡那霉素、庆大霉素和四环素)与蓝白斑筛选,用小量法提取重组杆状病毒质粒rBac-IL18、rBac-VP2、rBac-IL18-VP2、rBac-HA1、rBac-IL18-HA1,通过一对通用引物M13(Bacmid含有该引物Forward和Reverse两个引物位点,能够从两侧扩增LacZα互补区域内的mini-attTn7位点,有利于PCR分析)进行PCR扩增鉴定。在转染试剂CellfectinII的作用下,通过脂质体介导法将纯化的rBac-IL18、rBac-VP2、rBac-IL18-VP2、rBac-HA1、rBac-IL18-HA1转染至草地贪夜蛾细胞(Spodoptera frugiperda 9,sf9)获得P1代重组杆状病毒,用P1代病毒感染sf9来扩增病毒滴度,将达到一定滴度(10~7~10~8pfu/mL)的P3代重组杆状病毒感染sf9,感染72h后收获sf9细胞及培养上清,进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测和间接免疫荧光试验(IFA)检测。SDS-PAGE检测显示,mChIL-18、VP2、HA1基因均在sf9中的裂解上清中得到了高效表达,即表达的蛋白是可溶性的,表达的目的条带分子量分别约为19.5 KD, 48.4 KD, 37.4 KD。IFA检测显示mChIL18基因与VP2基因或HA1基因分别同时在同一细胞中独立表达。 采用鸡脾淋巴细胞增殖试验(MTT法)、IFN-γ诱导实验和水疱性口炎病毒(VSV)抑制试验对表达的蛋白进行生物学活性测定。鸡脾淋巴细胞增殖试验表明,不同浓度的pIL18、pVP2-IL18和pHA1-IL18均能够明显促进淋巴细胞的增殖,随着蛋白浓度的增加刺激转化作用逐渐增强,均当浓度为200ng/mL时,刺激转化效果最佳,增殖指数可达4.13、4.35、4.09,但随着蛋白浓度的增大淋巴细胞的增殖指数逐渐降低。VSV病毒活性抑制试验表明,当蛋白浓度大于100ng/mL时能刺激脾淋巴细胞产生IFN-γ,并且随着pIL18、pVP2-IL18和pHA1-IL18浓度的增加诱导产生IFN-γ的量随之增加;将不同稀释度的IFN-γ分别作用于VSV,在IFN-γ≥1×10~2U/mL时,具有较强的抑制效果,当IFN-γ为10 U/mL时,只能达到约50%的保护。该结果说明pIL18、pVP2-IL18和pHA1-IL18的抗病毒活性是通过IFN-γ实现的,且在一定浓度范围内具有抑制VSV病毒产生细胞病变的作用。 将含有pIL18、pVP2、pVP2-IL18的油乳剂疫苗分组免疫动物,14d时一免,28d时二免。I组为传统疫苗组;II组为pIL18与B78减毒疫苗联合疫苗组;III为pIL18与pVP2联合疫苗组;IV组为pVP2-IL18单独免疫组;V组一免注射B78减毒疫苗,二免注射pVP2-IL18;VI组为pVP2单独免疫组;VII组为对照组。从体液免疫和细胞免疫水平上分析试验结果。细胞免疫水平通过流式细胞术检测,从统计学意义上分析处理数据。结果表明,与免疫前和阴性对照组相比,各试验组都促进CD~(4+)和CD~(8+) T细胞增殖。一免后各试验组CD~(4+) T细胞都呈上升趋势,但一免后7d后又呈下降趋势;二免后I、III、V呈上升趋势且持续时间比较长,其中IV组CD~(4+) T增殖水平最高,在一免后21d、28d、35d都与其它组差异显著(P0.05)。一免后各试验组CD~(8+) T细胞都呈上升趋势,但一免后7d后又呈下降趋势;二免后各实验组仍呈不同下降趋势,其中I组CD~(8+) T增殖水平最高,在一免后14d、21d、28d都与其它组差异显著(P0.05)。体液免疫水平通过使用传染性法氏囊病病毒抗体检测试剂盒检测,从统计学意义上分析处理数据。结果表明,与免疫前相比,各试验组都有较好的促进IBD抗体生成作用,抗体水平都持续增高且维持时间也较长,都在在一免后28d抗体水平达到最高;与阴性对照组相比,IV组效果最好,抗体效价最高,V组次之,然后是II组、I组、III组、VI组。攻毒试验结果表明,IV组保护率可达90%,V组次之可达80%,然后是I组和II组75%、III组为70%、VI组50%,VII组无一幸免。 将含有pIL18、pHA1、pHA1-IL18的油乳剂疫苗分组免疫动物,7d时一免,21d时二免。I组为传统疫苗组;II组为pIL18与传统疫苗联合疫苗组;III为pHA1单独免疫组;IV组为pHA1-IL18单独免疫组;V组pIL18与pHA1联合疫苗组;VI组为pHA1单独免疫组;VII组为对照组。从体液免疫和细胞免疫水平上分析试验结果。细胞免疫水平通过流式细胞术检测。结果表明,与免疫前和阴性对照组相比,各试验组都能够明显促进CD~(4+)和CD~(8+) T细胞的增殖反应。一免后各试验组CD~(4+)和CD~(8+)T细胞都呈上升趋势,但一免后7d后又呈下降趋势;二免后虽呈上升趋势且持续时间比较长,但增殖幅度不大,以IV组CD~(4+) T增殖水平最高。体液免疫水平通过使用血凝抑制试验检测。结果表明,各试验组都有较好的促进ND、H5型AI和H9型AI抗体生成作用,都是在一免后28d抗体水平达到最高;与阴性对照组相比,IV组效果最好,抗体效价最高与其它组差异显著(P0.05)。
【学位授予单位】:山东农业大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2011
【分类号】:S852.4;Q78

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【引证文献】
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【共引文献】
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中国硕士学位论文全文数据库 前10条
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【同被引文献】
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中国硕士学位论文全文数据库 前1条
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10 吴一福;四军医大构建HBV全基因克隆质粒细胞系[N];中国医药报;2006年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 孔娜;mChIL-18基因与IBDV VP2基因或AIV HA1基因在pFastBac~(TM) Dual中的共表达及其免疫原性研究[D];山东农业大学;2011年
2 李志勇;调控玉米大斑病菌生长发育和致病性的CaM基因的克隆与功能分析[D];河北农业大学;2008年
3 谢科;水稻WRKY10基因的功能研究[D];浙江大学;2005年
4 邢继红;拟南芥抗灰葡萄孢相关基因的克隆和功能分析[D];河北农业大学;2006年
5 魏继承;白桦花期抑制性消减文库的构建及花发育相关基因的克隆[D];东北林业大学;2006年
6 赵明莲;食线虫真菌侵染性胞外蛋白酶的基因克隆与表达[D];云南大学;2003年
7 郭虹;弓形虫侵入相关分子ROP1基因的克隆及其DNA免疫研究[D];中山医科大学;1999年
8 王昕;巨噬细胞集落刺激因子可溶性受体的克隆表达及其相关性研究[D];中国协和医科大学;1998年
9 李伟;圆锥小麦地方品种遗传多样性研究[D];四川农业大学;2006年
10 段冷昕;梅花鹿茸多肽的化学结构及其抗肝纤维化作用[D];吉林大学;2007年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 鲍鸣;鸡IFN-γ基因的克隆与原核表达[D];安徽农业大学;2005年
2 刘占通;猪α干扰素基因克隆、原核表达及抗病毒活性研究[D];河南农业大学;2005年
3 张怡;重组鼠抗人CD19单链抗体的构建和表达[D];浙江大学;2006年
4 郝敏;玉米与大斑病菌构成的不同互作中基因表达的研究[D];河北农业大学;2006年
5 黄志强;产碱性蛋白酶海洋细菌的筛选及其基因克隆[D];福建农林大学;2006年
6 武鸿;嗜热脂肪地芽孢杆菌脂肪酶基因的克隆、表达及酶学性质研究[D];浙江大学;2007年
7 余国武;腊梅脂转移蛋白基因克隆与功能的初步分析[D];西南大学;2007年
8 赵秀振;蓖麻蚕体液胰凝乳蛋白酶抑制剂调查及其基因克隆[D];中国农业科学院;2007年
9 马维;辣椒疫病抗性相关基因的克隆与分析[D];西北农林科技大学;2007年
10 张琳琳;蜡样芽孢杆菌工程菌的构建及α-淀粉酶基因的表达[D];内蒙古农业大学;2007年
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