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《山东农业大学》 2011年
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猪肌内脂肪沉积相关基因的mRNA表达及功能分析

崔景香  
【摘要】：随着人们生活水平的提高,猪肉品质已引起了消费者和生产者的广泛重视。肌内脂肪(IMF)含量和背膘厚(BFT)是影响猪肉品质的两个重要指标,其中,IMF对肉的嫩度、多汁性和风味有明显的正效应。本研究以遗传背景有较大差异的地方品种莱芜猪、培育品种鲁莱黑猪、引入品种大白猪为研究对象,对影响猪脂肪细胞分化和脂肪细胞肥大的DGAT1、DGAT2、ADD1、PPARγ、ADRP和PID1六个候选基因进行了定量表达检测和遗传分析;进一步对其中与肌内脂肪显著相关的PID1基因,研究构建真核表达载体,并通过细胞转染进行鉴定,旨在为基因功能的验证奠定基础以及为猪肉质改良的标记辅助选择(MAS)筛选有效的分子标记提供理论依据。主要研究结果总结如下: 一、优化建立了TaqMan探针定量分析法,并与SYBR Green real-time PCR方法进行了比较,结果表明,利用TaqMan探针法对ADD1基因进行定量表达检测,能够比SYBR Green real-time PCR更加快速和准确,且不影响相关分析结果。ADD1基因在莱芜猪脂肪组织中表达量最高,在肝脏中未见明显表达,并且脂肪组织和肌肉组织间的表达量差异显著(P0.05)。ADD1基因的mRNA表达量在肌肉组织中与IMF含量呈显著正相关(P0.05)。 二、DGAT1和DGAT2在同一猪种不同组织中的mRNA表达水平有显著差异(P0.05),总体表现为:肝脏脂肪肌肉;在不同品种猪的3种组织中的mRNA表达量总体表现为:莱芜猪鲁莱黑猪大白猪;但DGAT1基因在不同品种猪脂肪组织中的表达顺序为:大白猪鲁莱黑猪莱芜猪;相关性分析结果表明,DGAT1基因在3种猪品种间的肝脏组织中mRNA表达量与BFT呈显著正相关(P0.05);DGAT2基因在3种猪品种间的肌肉组织中mRNA表达量与IMF含量呈显著正相关(P0.05)。 三、PPARγ和ADRP基因在3个品种猪的肌肉组织中的mRNA表达量总体表现为:莱芜猪鲁莱黑猪大白猪;相关性分析结果表明,PPARγ的mRNA表达量在3个猪种的肌肉中mRNA表达量与IMF呈显著正相关(P0.05),ADRP的mRNA表达量在3个猪种的肌肉中与IMF相关不显著(P0.05),PPARγ的mRNA表达量与ADRP的mRNA表达量呈极显著正相关(P0.01)。证实了PPARγ与脂肪沉积性状存在一定的内在联系,也提示PPARγ和ADRP基因之间存在一定的联系,其结果为进一步研究莱芜猪高肌内脂肪沉积的分子调控机制提供了新的资料。 四、猪品种因素对PID1基因的mRNA表达量具有显著效应(P0.05),总体表现为:莱芜猪鲁莱黑猪大白猪。不同组织对PID1基因的mRNA表达量具有显著效应(P0.05),总体表现为:肝脏脂肪肌肉。品种与组织之间的互作对该基因表达量也具有显著影响(P0.05);相关性分析结果表明:不同品种间的三种组织中PID1基因的mRNA表达量与IMF含量之间呈现出显著正相关(P0.05)。 五、PID1基因的真核表达载体构建与遗传鉴定克隆得到PID1基因的编码区序列,成功构建了PID1基因的真核表达载体,命名为:pcDNA3.1(+)/PID1。采用脂质体介导转染山羊毛囊细胞,RT-PCR检测PID1基因的mRNA水平的表达,结果表明,转染pcDNA3.1(+)/PID1质粒的毛囊细胞中PID1基因的表达水平显著高于对照组转染空质粒的毛囊细胞(P0.05);Western blotting检测PID1翻译水平的表达,结果表明,PID1基因的蛋白得到有效表达。这些研究结果为进一步验证PID1基因的功能奠定了基础。 综上所述,采用荧光定量分析、克隆测序、Western blotting、真核表达载体构建和细胞转染等一系列研究方法,对参与脂肪形成与分化和肌内脂肪代谢调控的相关基因进行了研究,并对其中与IMF沉积显著相关的PID1基因进行了进一步的功能分析,所得研究结果为进一步揭示猪肌肉中的脂肪沉积与遗传机理奠定了重要的分子基础。
【关键词】：猪 肌内脂肪 荧光定量-PCR 真核表达 蛋白表达
【学位授予单位】：山东农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2011
【分类号】：S828
【目录】：
  • 符号说明5-8
  • 中文摘要8-10
  • Abstract10-12
  • 1 引言12-30
  • 1.1 猪脂肪沉积的过程及脂类代谢的调控12-17
  • 1.2 IMF与肉质17-18
  • 1.3 猪品种（系）间差异对IMF 含量的影响18
  • 1.4 猪IMF 沉积候选基因的研究进展18-25
  • 1.4.1 ADD1 基因的研究进展19-20
  • 1.4.2 DGATs 基因的研究进展20-21
  • 1.4.3 过氧化物酶体增殖物激活受体基因21-23
  • 1.4.4 ADRP 基因的研究进展23-24
  • 1.4.5 PID1 基因的研究进展24-25
  • 1.5 实时荧光定量PCR（FQ-PCR）技术及其应用25-28
  • 1.5.1 FQ-PCR 的原理25-26
  • 1.5.2 FQ-PCR 的定量方法26-27
  • 1.5.3 FQ-PCR 技术的应用及展望27-28
  • 1.6 本研究的目的意义28-30
  • 2 材料与方法30-54
  • 2.1 试验材料30-35
  • 2.1.1 试验动物和样品采集30
  • 2.1.2 菌株、载体和细胞30
  • 2.1.3 主要仪器30-31
  • 2.1.4 酶和试剂31-35
  • 2.1.5 主要数据库及生物软件35
  • 2.2 试验方法35-54
  • 2.2.1 肌内脂肪含量和背膘厚的测定35-36
  • 2.2.2 引物设计36-38
  • 2.2.3 总RNA 的提取38-39
  • 2.2.4 cDNA 第一条链的合成和检测39
  • 2.2.5 TaqMan 探针定量 PCR 检测猪 ADD1 基因表达的研究39-44
  • 2.2.6 候选基因 mRNA 表达及功能分析44-46
  • 2.2.7 PID1 基因的克隆与真核表达载体的构建46-53
  • 2.2.8 数据分析53-54
  • 3 结果与分析54-75
  • 3.1 TaqMan 探针法检测猪ADD1 基因m RNA 表达的研究54-56
  • 3.2 候选基因在三种猪三种组织中 mRNA 的表达及其与脂肪沉积的研究56-65
  • 3.3 候选基因在莱芜猪三个组织中 mRNA 表达差异的研究65-70
  • 3.4 PID1 真核表达载体的构建70-73
  • 3.5 PID1 真核表达载体的表达73-75
  • 4 讨论75-80
  • 4.1 TaqMan 探针法检测猪ADD1 基因mRNA 表达的研究75-76
  • 4.2 猪脂肪细胞分化相关候选基因 mRNA 表达及功能分析76-77
  • 4.3 猪脂肪细胞肥大相关候选基因 mRNA 表达及功能分析77-78
  • 4.4 莱芜猪中候选基因的m RNA 表达及功能分析78-79
  • 4.5 PID1 真核表达载体的构建和鉴定79-80
  • 5 结论80-81
  • 5.1 建立 TaqMan 探针检测猪 ADD1 基因 mRNA 表达检测技术体系80
  • 5.2 利用 FQ-PCR 对猪 IMF 沉积相关基因进行 mRNA 表达及功能分析80
  • 5.3 PID1 真核表达载体的构建和鉴定80-81
  • 6 参考文献81-93
  • 7 致谢93-94
  • 8 攻读博士期间发表论文情况94-95
  • 博士学位论文内容简介及自评95

【引证文献】
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3 王秒;P2Y受体介导大鼠胃体环行肌收缩反应及相关受体亚型mRNA和受体蛋白的表达[D];河北医科大学;2010年
4 唐伟;针刺预处理对全脑缺血大鼠脑保护机制的实验研究[D];黑龙江中医药大学;2004年
5 樊慧杰;大鼠急性心肌缺血心脏和背根神经节差异蛋白质组学和mRNA研究[D];山西医科大学;2011年
6 李恒;人源CFI_m复合物识别pre-mRNA的分子机制及酵母Pub1蛋白结构的生物学研究[D];中国科学技术大学;2010年
7 孙士鹏;内含HIV-1 gag编码mRNA的MS2病毒样颗粒构建及体外表达和体内免疫应答研究[D];北京协和医学院;2011年
8 姜浩;青藤碱对大鼠DR中NF-κB及部分促炎因子mRNA表达影响的实验研究[D];天津医科大学;2010年
9 张久丽;鸡SelN的体内分布及硒对其在肌组织中转录的调控[D];东北农业大学;2010年
10 刘丽艳;CYP1A1与PPARα多态性及mRNA水平在酒精性肝病中的研究[D];吉林大学;2011年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 范东芬;拟黑多刺蚁acetylcholinesterase基因的克隆mRNA水平表达及其与发育相关性研究[D];陕西师范大学;2011年
2 周安韦;嗜卷书虱羧酸酯酶生化毒理学特性及其mRNA表达水平研究[D];西南大学;2010年
3 李希;饲粮硒水平对妊娠Wistar大鼠胰岛素抵抗状态及胰腺7个硒蛋白基因mRNA丰度影响的研究[D];四川农业大学;2010年
4 赖娅莉;蝎毒对锂—匹罗卡品模型大鼠癫痫持续状态的疗效及对海马S-100β mRNA表达的影响[D];泸州医学院;2011年
5 张成大;mRNA定量分析检测Notch信号传导通路在人原发性肝癌组织中的表达[D];河北医科大学;2011年
6 曹骥;外周血AFP-mRNA和ALB-mRNA的检测及其临床意义[D];广西医科大学;2000年
7 刘霞;活化NF-κ Bp65mRNA、IL-1βmRNA、IL-4mRNA在MsPGN中检测及其意义[D];新疆医科大学;2003年
8 寇晨光;胰岛素干预对体外高糖环境大鼠肝细胞白蛋白mRNA表达影响的研究[D];青岛大学;2010年
9 黄家保;小菜蛾取食诱导的菜心mRNA表达谱及差异表达基因克隆[D];福建农林大学;2010年
10 詹邶;实验性葡萄膜炎大鼠眼部IL-23mRNA及IL-17mRNA的表达[D];安徽医科大学;2011年
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