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《山东农业大学》 2011年
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玉米促分裂原活化蛋白激酶C族MAPKK基因ZmMKK4的分离及功能分析

孔祥培  
【摘要】:非生物胁迫是影响植物生长发育和产量的重要环境因素,而其中又以干旱、低温和盐渍的影响最为严重。植物在长期的进化过程中形成了一套主动的防御机制,能够识别逆境信息并通过信号传递最终调节植物的生长发育,从而抵御不良环境的影响。大量研究表明,在逆境条件下植物体内积累渗透调节物质如脯氨酸、可溶性糖、甜菜碱等,同时,许多基因被诱导表达。植物体内存在复杂的信号传递途径,蛋白质的可逆磷酸化反应对于信号的快速、精确传递起着重要作用。其中蛋白质的磷酸化是由蛋白激酶催化完成。MAPK级联途径是存在于真核生物中进化上保守的信号通路,在细胞信号的转换和放大过程中起重要作用。MAPK级联途径由三个成员组成,分别是MAPK、MAPKK及MAPKKK,此三个信号组分按照MAPKKK-MAPKK-MAPK的方式依次磷酸化,将外源信号级联放大向下传递。基因的数量显示MAPKK位于MAPK级联途径的关键环节,MAPKKs通过整合不同MAPKKKs接受的多种信号,并将这些信号传递给下游MAPKs。到目前为止,不同的研究鉴定了多种植物中的MAPKKs,但在玉米中仅分离到ZmMEK1和ZmMAPKK1。早期的研究发现,ZmMEK1与玉米根尖的增殖有关,另外,该激酶也能够被NaCl轻微的诱导。关于ZmMAPKK1的功能的研究还未见报道。 本研究从玉米品种郑单958根系中分离到一个C组MAPKK基因,命名为ZmMKK4,对其序列特征、表达模式,以及过表达转基因拟南芥和烟草的抗逆生理功能做了初步研究。主要结果如下: (1)从玉米分离到促分裂原蛋白激酶激酶ZmMKK4,该基因开放阅读框编码一个357个氨基酸的蛋白,蛋白序列分析发现该蛋白具有进化上保守的11个蛋白激酶催化结构域,并且在N端有一个保守的MAPK的锚定位点。进化树分析表明,ZmMKK4属于C族的MAPKK。 (2)构建pBI121-ZmMKK4-GFP表达载体,并在洋葱表皮细胞中瞬时表达。在荧光显微镜下观察到细胞核内有GFP激发的绿色荧光,说明ZmMKK4定位于细胞核。 (3)Northern杂交结果表明,ZmMKK4在玉米根、茎、叶中均有表达,在叶中表达量最高。低温、NaCl处理和外施H2O2均能诱导ZmMKK4的表达,而外施ABA抑制ZmMKK4的表达,表明ZmMKK4可能参与调控高盐和低温胁迫,而H2O2信号介导了这一过程。 (4)构建pBI-ZmMKK4正义表达载体,成功转化拟南芥和烟草。RT-PCR和Westernblot结果均表明,ZmMKK4已经在转基因植株中稳定表达。 (5)高盐处理条件下,过量表达ZmMKK4基因的转基因拟南芥种子比野生型拟南芥种子萌发率高,转基因拟南芥幼苗的生长比野生型拟南芥幼苗好。 (6)低温处理条件下,过量表达ZmMKK4基因的转基因拟南芥幼苗比野生型拟南芥幼苗的叶绿素含量高,转基因拟南芥植株比野生型拟南芥植株的存活率高。 (7)干旱胁迫处理下,过表达ZmMKK4的转基因烟草的抗氧化能力得到改善。转基因烟草比野生型烟草细胞内源H_2O_2积累量少,氧化胁迫较轻。 (8)低温、高盐和干旱条件下,转基因植株相容性物质脯氨酸、可溶性糖的积累,以及抗氧化酶的活性明显高于野生型植株。 (9)高盐和低温胁迫下,过表达ZmMKK4的转基因拟南芥增强了内源AtMPK4的活性。 (10)低温、高盐和干旱条件下,过表达ZmMKK4的转基因植株增强了胁迫相关基因的表达。
【学位授予单位】:山东农业大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2011
【分类号】:S513

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