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《山东农业大学》 2011年
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苹果bHLH基因MdCIbHLH1克隆及功能分析

冯晓明  
【摘要】:苹果(Malus domestica B.)是世界上栽培最广泛的果树之一。提高苹果产量能够缓解农产品供给压力并且给果农带来更多经济效益。在许多商业苹果栽培地区,低温是限制苹果产量的主要环境因素之一。本研究筛选得到一个低温响应的苹果嘎啦(Malus×domestic cv.‘Royal Gala’)基因MdCIbHLH1,并通过农杆菌介导的方法将该基因转入苹果愈伤、烟草、拟南芥以及苹果组培苗中,对MdCIbHLH1基因的功能进行了研究。 1. MdCIbHLH1基因的克隆 根据拟南芥bHLH转录因子序列,在GenBank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)已发表的苹果EST序列中搜索同源序列。通过半定量PCR的方法筛选到一个低温诱导的苹果bHLH转录因子并克隆基因全长,将其命名为MdCIbHLH1(Cold-Induced bHLH1;GenBank accession number ABS50521)。 2. MdCIbHLH1序列分析 MdCIbHLH1编码区长1 596 bp,编码531个氨基酸,分子量为57.4 kD。序列分析表明MdCIbHLH1具有3个内含子。利用MEGA 4.0对bHLH蛋白进行进化树分析。将MdCIbHLH1和所有的拟南芥bHLH蛋白进行聚类,发现MdCIbHLH1蛋白与AtbHLH116(AtICE1: INDUCER OF CBF3 EXPRESSION1)和AtbHLH033(AtICE2)紧密聚在一起。基因组比较分析表明,它们的基因组结构相似,都含有4个外显子。 3. MdCIbHLH1的组织表达分析和逆境响应分析 通过定量和半定量PCR对MdCIbHLH1在各组织中的转录水平进行分析。结果表明:MdCIbHLH1呈组成型表达,在苹果的春梢、休眠芽、花苞、花、幼叶、成熟叶片、幼果、果皮以及愈伤组织中均检测到该基因的表达。在花苞、盛花、幼梢、幼果等幼嫩器官中,MdCIbHLH1的表达受低温诱导。另外,苹果中两个CBF-like基因MdDREB1和MdCBF1在这些器官中也受低温诱导。利用半定量PCR检测苹果实生苗中MdCIbHLH1基因在非生物胁迫条件下的表达情况,结果表明MdCIbHLH1受低温、盐、ABA、PEG诱导上调。同时MdDREB1和MdCBF1也随着MdCIbHLH1的上调表达也上调。 4. MdCIbHLH1与拟南芥AtCBF3基因的启动子结合 利用EMSA技术检测MdCIbHLH1蛋白能否特异地结合到拟南芥CBF3启动子的MYC识别位点上。在拟南芥中,AtCBF3的启动子区域有4类MYC识别位点(CANNTG;MYC1,MYC2,MYC3(5)以及MYC4)。结果表明MdCIbHLH1蛋白能结合到MYC1-MYC4识别位点上,竞争能明显减弱MdCIbHLH1蛋白与MYC4的杂交信号,而突变的竞争探针不能减弱杂交信号,说明MdCIbHLH1蛋白与AtCBF3启动子的MYC4位点是特异结合的。但是竞争对MYC1、MYC2和MYC3(5)没有作用,说明MdCIbHLH1蛋白与它们的结合作用是非特异的。 5.在愈伤组织中过表达MdCIbHLH1基因 我们检测了MdCIbHLH1基因在活体条件下的功能。将CaMV35S启动子启动的MdCIbHLH1-GFP融合基因通过农杆菌介导的方式转入苹果愈伤组织。半定量结果显示:MdCIbHLH1在转基因愈伤组织中表达水平提高。MbDREB1和MdCBF1表达水平也相应提高,说明MdCIbHLH1基因可能在这两个基因的上游调控它们的表达。此外,还鉴定了转基因对愈伤组织生长的影响。结果表明转基因愈伤组织在低温和盐处理23天后生长量大于对照愈伤,说明转基因愈伤组织提高了对低温和盐的抗性。 6. MdCIbHLH1蛋白的降解和蛋白质修饰 为了检测MdCIbHLH1-GFP蛋白在低温下的表达水平,我们提取了转基因愈伤组织(TGC)的蛋白,并利用Western杂交技术检测了MdCIbHLH1-GFP的表达情况。结果表明在冷处理0.5小时后,MdCIbHLH1-GFP蛋白积累量明显下调,说明可能存在蛋白质修饰过程。为了检测MdCIbHLH1蛋白是否发生泛素化和SUMO化,我们利用anti-GFP抗体免疫沉淀MdCIbHLH1-GFP蛋白,然后用anti-ubiquitin和anti-SUMO抗体进行杂交,结果表明这两个抗体都检测到阳性信号,说明MdCIbHLH1蛋白在活体条件下能发生泛素和SUMO化蛋白修饰。 7.在烟草、拟南芥以及苹果中过量表达MdCIbHLH1基因 为了检测MdCIbHLH1基因在植物体中的功能,我们构建了过表达载体,用35S启动子启动MdCIbHLH1基因,并转化烟草、拟南芥以及苹果。MdCIbHLH1过表达提高了转基因植株的低温抗性,说明该基因与低温抗性有关。
【学位授予单位】:山东农业大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2011
【分类号】:S661.1

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【引证文献】
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【参考文献】
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【同被引文献】
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