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《山东农业大学》 2011年
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嗜热毛壳菌超氧化物歧化酶基因的克隆、表达及转基因烟草耐盐性研究

张丽青  
【摘要】：超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase,SOD)能够催化超氧阴离子(O2.~-)发生歧化反应,在生物体防御氧化损伤的过程中,发挥着重要作用。根据酶分子中所含金属辅基的不同,超氧化物歧化酶主要可分为Cu,Zn-SOD,Mn-SOD,Fe-SOD等类型。 超氧化物歧化酶已在食品、医药、化妆品和农业等领域中得到了广泛的应用,具有重要商业价值。但市场应用的超氧化物歧化酶主要来源于常温生物,因此酶的半衰期短,热稳定性差,储存期短,导致产品成本高,而制约超氧化物歧化酶在农业、工业中的应用。由此可见,热稳定性超氧化物歧化酶的研究和开发具有重要意义。 嗜热毛壳菌(Chaetomium thermophilum CT2)是广泛分布的,生长上限温度较高的嗜热真菌,从这种真菌中已分离了多种嗜热酶,具有极大的研究和应用价值。本研究通过RT-PCR和Tail-PCR从嗜热毛壳菌中分离到了一个新的Mn-SOD酶基因,序列分析表明该基因全长cDNA序列为684bp,编码227个氨基酸,具有信号肽。将该基因在毕赤酵母中表达,经甲醇诱导表达6d后酶活最高可达1020U/ml,蛋白量达0.93mg/ml。经硫酸铵沉淀、DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子交换等步骤纯化了该重组蛋白,SDS-PAGE显示该重组蛋白大小约为22.7kDa,与推测的蛋白分子量相似。重组酶的最适反应温度和最适pH值分别为60℃和6.0,该酶具有较高的热稳定性,70℃处理60min后,残余酶活为71%。 本研究还从嗜热毛壳菌中克隆了一种Cu,Zn-SOD基因并将其在毕赤酵母中进行了高效表达。经甲醇诱导表达6d后酶活最高可达1660U/ml,蛋白量达1.54mg/ml。经硫酸铵沉淀、DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子交换等步骤纯化了该重组蛋白,SDS-PAGE显示该重组蛋白大小约为17 kDa,该重组酶的最适反应温度和最适pH值分别为60℃和6.5。70℃处理60min后,残余酶活为65%,在80和90℃下的半衰期分别为22和7min。 比较上述构建的重组酵母GS115(pPIC9K/mnsod)和GS115(pPIC9K/czsod)与非重组酵母(pPIC9K)在不同浓度NaCl、百草枯、甲萘醌和H_2O_2胁迫下的生长状况,验证嗜热毛壳菌mnsod及czsod基因对不同非生物胁迫的抵抗能力。结果表明嗜热毛壳菌mnsod及czsod基因对包括盐、百草枯、甲萘醌、过氧化物等多种胁迫具有抵抗能力。 盐胁迫是自然界中主要的非生物胁迫之一,是影响植物生长发育的主要因素,盐胁迫的适应机制在许多模式生物中广泛研究。利用基因工程技术提高植物耐盐性是解决这一问题的最有效途径之一。研究抗逆相关基因的抗逆功能是基因工程抗性育种的前提。当植物遭受包括高盐、干旱、低温和高温等环境胁迫时可产生大量活性氧。活性氧进而破坏细胞内的大分子,从而使DNA裂解,造成膜的损伤或影响蛋白质的合成及稳定性等。因此,对植物来说有效的活性氧清除系统非常重要。 植物的超氧化物歧化酶活性与其在盐胁迫下的防御能力密切相关。关于逆境胁迫下SOD活性增高的生理关系已有报道,表明植物体内的SOD活性增高可以增强其对逆境胁迫的抵抗能力。到目前为止已报道多种转SOD基因植物对盐胁迫的抗性。 为了验证盐胁迫下嗜热毛壳菌mnsod及czsod的基因功能,将mnsod及czsod基因分别构建到35s启动子驱动的植物表达载体pROKⅡ中,通过农杆菌介导法转化烟草。经PCR、southern杂交和RT-PCR检测表明嗜热毛壳菌的mnsod及czsod基因分别整合到烟草基因组中。 通过分析高盐胁迫下非转基因和转基因烟草的种子萌发率表明,转mnsod基因和转czsod基因的烟草种子比野生型烟草种子的萌发率高,且两种转基因烟草的根生长受到的抑制都比野生型小。说明转嗜热毛壳菌sod基因提高了烟草在种子萌发及小苗生长阶段的耐盐性。 盐分胁迫会使植物膜系统受到伤害,导致植株的叶片MDA含量升高,膜脂过氧化作用增强。本实验中盐胁迫处理使转基因植株与野生型植物叶片的丙二醛含量都有所上升,但两种转基因烟草植株的MDA含量显著低于未转基因植株。说明转基因烟草膜脂过氧化程度低于野生型烟草,膜伤害程度较轻。该结果表明在盐胁迫下转基因植株与野生型植株相比具有明显提高的抗盐性。 在盐胁迫条件下,转mnsod基因和转czsod基因烟草株系的SOD活性与野生型一样都呈先升高后降低的趋势,但两种转基因烟草SOD活性都比非转基因烟草高的多。研究了两种转基因烟草植株的抗病害能力,结果表明两种转基因植株对烟草炭疽病和赤星病有一定的抵抗能力,且转mnsod基因比转czsod基因烟草的抗病能力更强。
【关键词】：嗜热毛壳菌 热稳定超氧化物歧化酶 基因克隆 表达 转基因烟草 盐胁迫
【学位授予单位】：山东农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2011
【分类号】：S572
【目录】：
  • 符号说明5-10
  • 中文摘要10-12
  • 英文摘要12-15
  • 1 前言15-29
  • 1.1 超氧化物歧化酶的种类与分布15-16
  • 1.2 超氧化物歧化酶的结构和理化特性16-18
  • 1.2.1 SOD 的结构16-18
  • 1.2.2 SOD 的理化特性18
  • 1.2.2.1 SOD 对氰化物和H_20_2 的敏感性18
  • 1.2.2.2 SOD 的吸收光谱特性18
  • 1.2.2.3 SOD 是亲水性的蛋白质18
  • 1.3 SOD 基因的克隆和表达18-20
  • 1.4 超氧化物歧化酶的功能及应用20-26
  • 1.4.1 超氧化物歧化酶的功能20-23
  • 1.4.1.1 SOD 对辐射的防护作用20-21
  • 1.4.1.2 SOD 对肿瘤的作用21
  • 1.4.1.3 SOD 与衰老21-22
  • 1.4.1.4 SOD 与植物抗逆的关系22-23
  • 1.4.2 超氧化物歧化酶的应用23-26
  • 1.4.2.1 SOD 在化妆品领域中的应用23-24
  • 1.4.2.2 SOD 在医学中的应用24-25
  • 1.4.2.3 SOD 在食品工业中的应用前景25
  • 1.4.2.4 SOD 与转基因植物25-26
  • 1.5 选题的目的意义、研究内容26-29
  • 2 材料与方法29-61
  • 2.1 实验材料29-34
  • 2.1.1 菌株与质粒29
  • 2.1.2 酶和生化试剂29
  • 2.1.3 主要仪器29-30
  • 2.1.4 培养基及有关溶剂的配制30-34
  • 2.1.4.1 培养基30-31
  • 2.1.4.2 溶液配制31-34
  • 2.1.5 PCR 引物34
  • 2.1.5.1 Mn-SOD 基因克隆表达引物34
  • 2.1.5.2 Cu,Zn-SOD 基因表达引物34
  • 2.2 实验方法34-61
  • 2.2.1 嗜热毛壳菌SOD 基因克隆34-39
  • 2.2.1.1 嗜热毛壳菌菌丝体DNA 的抽提34-35
  • 2.2.1.2 C.thermophilum Mn-SOD 基因 5′末端的分离(TAIL-PCR)35-37
  • 2.2.1.3 重组质粒的筛选与鉴定37-38
  • 2.2.1.4 序列测定38
  • 2.2.1.5 总RNA 的提取（Trizol 法）38
  • 2.2.1.6 反转录cDNA 第一链的合成38-39
  • 2.2.1.7 目的基因全长cDNA 的克隆39
  • 2.2.1.8 全长序列的生物信息学分析39
  • 2.2.2 嗜热毛壳菌 SOD 基因在毕赤酵母中的表达、纯化与性质39-50
  • 2.2.2.1 嗜热毛壳菌SOD 成熟肽基因序列的分离39-41
  • 2.2.2.2 酵母表达载体的构建41
  • 2.2.2.3 线性化质粒DNA 制备41-42
  • 2.2.2.4 酵母转化42-43
  • 2.2.2.5 酵母转化子的鉴定和筛选43-45
  • 2.2.2.6 外源基因多拷贝整合转化子筛选45-46
  • 2.2.2.7 酵母工程的培养和SOD 的诱导分泌表达46
  • 2.2.2.8 表达产物的生物学活性检测及SDS-PAGE 分析46-47
  • 2.2.2.9 重组酶的纯化及酶学性质47-50
  • 2.2.3 工程酵母的抗逆性分析50
  • 2.2.3.1 非胁迫处理50
  • 2.2.3.2 胁迫处理50
  • 2.2.4 嗜热毛壳菌sod（Ctsod）基因在烟草中的转化及抗盐性50-61
  • 2.2.4.1 目的基因的克隆50-52
  • 2.2.4.2 植物表达载体的构建52
  • 2.2.4.3 转化农杆菌52-54
  • 2.2.4.4 农杆菌介导的烟草基因转化54-55
  • 2.2.4.5 转基因烟草植株的分子生物学检测55-59
  • 2.2.4.6 SOD 活性的测定59-60
  • 2.2.4.7 转基因烟草的抗病性检测60
  • 2.2.4.8 转基因烟草的抗盐性分析60-61
  • 3 结果与分析61-107
  • 3.1 C.thermophilum CT2 sod 基因的克隆、表达及酶学性质61-84
  • 3.1.1 C.thermophilum CT2 总RNA 的提取61
  • 3.1.2 C.thermophilum CT2 mnsod 基因的克隆、表达及酶学性质61-75
  • 3.1.2.1 C.thermophilum CT2 mnsod 基因5′末端的分离61-62
  • 3.1.2.2 C.thermophilum CT2 mnsod 全长cDNA 的分离62-63
  • 3.1.2.3 C.thermophilum CT2 mnsod 基因的核苷酸和氨基酸序列分析63-67
  • 3.1.2.4 嗜热毛壳菌mnsod 基因在毕赤酵母中的高效表达67-72
  • 3.1.2.5 重组Mn-SOD 的分离纯化及性质测定72-75
  • 3.1.3 C.thermophilum CT2 czsod 基因的克隆、表达及酶学性质75-84
  • 3.1.3.1 C.thermophilum CT2 czsod 基因cDNA 的分离75-76
  • 3.1.3.2 C. thermophilum czsod 的核苷酸和氨基酸序列分析76-81
  • 3.1.3.3 重组Cu,Zn-SOD 的分离纯化及性质测定81-84
  • 3.2 工程酵母的抗逆性分析84-87
  • 3.2.1 嗜热毛壳菌czsod 基因与逆境84-85
  • 3.2.2 嗜热毛壳菌mnsod 基因与逆境85-87
  • 3.3 嗜热毛壳菌sod（Ctsod）基因在烟草中的转化及抗盐性分析87-107
  • 3.3.1 嗜热毛壳菌mnsod 转化烟草及抗盐性分析87-97
  • 3.3.1.1 植物表达载体(pROKⅡ/mnsod)的构建87-89
  • 3.3.1.2 转化农杆菌89
  • 3.3.1.3 LBA4404(pROKⅡ/mnsod)转化烟草89-90
  • 3.3.1.4 转基因烟草的分子检测90-92
  • 3.3.1.5 转mnsod 基因烟草与非转基因烟草SOD 含量的测定92
  • 3.3.1.6 转mnsod 基因烟草的抗病性分析92-94
  • 3.3.1.7 转mnsod 基因烟草对盐胁迫的抗性94-97
  • 3.3.2 嗜热毛壳菌czsod 基因转化烟草及抗盐性分析97-107
  • 3.3.2.1 植物表达载体（pROKⅡ/czsod）的构建97-98
  • 3.3.2.2 转化农杆菌98
  • 3.3.2.3 LBA4404（pROKⅡ/czsod）转化烟草98-100
  • 3.3.2.4 转基因烟草的分子检测100-102
  • 3.3.2.5 转czsod 基因与非转基因烟草SOD 含量的测定102
  • 3.3.2.6 转czsod 基因烟草的抗病性分析102-103
  • 3.3.2.7 转 czsod 基因烟草对盐胁迫的抗性103-107
  • 4 讨论107-119
  • 4.1 嗜热毛壳菌SOD 酶的高效表达及热稳定性研究107-112
  • 4.1.1 表达系统的选择107-108
  • 4.1.2 影响毕赤酵母高效表达的因素108-110
  • 4.1.3 重组超氧化物歧化酶的纯化110
  • 4.1.4 重组超氧化物歧化酶的热稳定性110-111
  • 4.1.5 热稳定酶的耐热机制111-112
  • 4.2 工程酵母抗非生物胁迫的研究112-113
  • 4.3 转嗜热毛壳菌sod 基因烟草的抗盐性研究113-119
  • 4.3.1 自由基、活性氧对植物的伤害113-114
  • 4.3.2 野生型与转嗜热毛壳菌sod 基因烟草对盐胁迫抗性的比较114-116
  • 4.3.3 盐胁迫下野生型与转sod 基因烟草的丙二醛（MDA）含量比较116-117
  • 4.3.4 野生型与转sod 基因烟草抗病性比较117-119
  • 5 结论119-120
  • 参考文献120-134
  • 致谢134-135
  • 攻读学位期间发表论文情况135

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6 刘杨;盐藻耐盐相关序列DSG10的功能预测及其转基因烟草鉴定[D];四川大学;2002年
7 张冉;α-法尼烯合成酶基因转化拟南芥和烟草的研究[D];山东农业大学;2011年
8 高宇;Resveratrol Synthase基因的克隆及表达研究[D];中国农业科学院;2003年
9 王宇尘;转F3’5’H基因烟草的花色改变[D];西南大学;2005年
10 张丹;鸡传染性法氏囊病病毒VP2基因在转基因烟草中的表达[D];中国农业大学;2003年
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