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《山东农业大学》 2011年
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水稻条纹病毒(RSV)RNA3、RNA4的克隆与抗RSV转基因水稻的培育

马进  
【摘要】:水稻条纹叶枯病(Rice stripe disease)是水稻上普遍发生、危害严重的一种病毒病,其病原为水稻条纹病毒(Rice stripe virus, RSV)。近年来,随着种植方式的改变,耕作栽培技术的变化,导致水稻条纹叶枯病在黄淮稻区迅速回升,1999年后暴发成灾,目前己成为该稻区水稻生产上最主要的病害。水稻感染RSV后,造成水稻心叶褪绿,捻转,并弧圈装下垂,严重的心叶枯死,导致水稻产量大幅降低,甚至绝产。RSV主要由介体灰飞虱持久性经卵传播,电镜下观察病毒粒子呈丝状粒体,以折叠、分枝和超螺旋等形式存在。RNA介导的病毒抗性(RNA-Mediated Virus Resistance, RMVR)是近年来发展起来的一种新的抗病毒基因工程策略,其通过对入侵的病毒RNA进行降解,使入侵的病毒不能在植物中积累,从而赋予转基因植物病毒抗性。本研究探求了RSV致病性增强的分子机理,并培育了高抗且稳定遗传到T2代的抗水稻条纹病毒的转基因水稻,对于提高水稻的产量,保护水稻生产的可持续发展,具有重大意义。研究结果和主要结论如下: (1)水稻条纹病毒山东济宁分离物的分子变异分析 传统的生物学测定发现RSV不同分离物之间存在着化学组成和致病性上的差异。近些年的研究表明,这种差异同样表现在核苷酸的水平。通过对部分分离物的RNA3、RNA4或部分编码基因的序列分析发现,RSV的基因序列和5′端及3′端非编码区序列相当保守,变异主要发生在基因间隔区(IR),但目前尚缺乏对不同类型病毒种群的遗传变异的系统分析。 从山东济宁感病的水稻上,分离到强致病性水稻条纹病毒,命名为RSV-SD-JN2。为了从分子水平探讨RSV-SD-JN2变异及其致病性增强的原因,采用RT-PCR技术,克隆RSV-SD-JN2的RNA3.RNA4区段cDNA。序列测定结果显示,RSV-SD-JN2的RNA3和RNA4核苷酸序列长度分别为2487bp、2157bp;RNA3中,NS3基因长为636bp,IR为725bp,CP基因为969bp;RNA4中,SP基因长为537bp,IR为654bp,NSvc4基因为861bp。 将RSV-SD-JN2与不同时期、不同区域和不同致病性的辽宁盘锦PJ、北京双桥SQ、江苏洪泽HZ、云南昆明KM、山东济宁SD-JN1,江苏江阴JY、浙江ZHEJIANG分离物的RNA3、RNA4全序列或部分序列进行比较分析,发现RNA3、RNA4序列5′和3′末端非编码区具有高度保守,仅存在个别碱基的差异;基因编码区保守性较高,核苷酸序列同源性均在93%以上,氨基酸序列同源性高达97%以上,且大部分碱基变异为无意义变异;IR易于变异,IR4的核苷酸序列同源性仅在91.6%-94.3%之间,而IR3的同源性为85.8%-96.7%。IR的变异导致RNA二级结构一发夹结构的稳定性提高是病毒致病性增强的重要原因。同时发现,SD-JN2分离物的RNA3内部各个序列可能存在不同的亲缘关系;NS3基因和CP基因与HZ分离物有很高的同源性,分别为98.9%和99.1%;而IR仅为86.3%,推测是由不同亚群的分离物的基因组相应片段经过交换重配引起的。 (2)抗RSV两种分离物转基因水稻新种质的培育 目前,种植抗条纹叶枯病品种是防治RSV最根本、有效的方法。而粳稻是黄淮稻区主要的种植品种,由于粳稻中缺少抗条纹叶枯病基因,病害的流行和发生已经给水稻生产造成重大损失。常规的培育水稻抗病品种的方法周期长、效率低。RNA介导病毒抗性是目前培育抗病毒作物最为有效而且快捷的方式,其具有抗性表型近乎免疫、抗性持久、生物安全性高等特点,是一种具有实际应用价值的植物抗病毒基因工程策略。但是RNA介导的病毒抗性还具有抗病性谱窄的缺点。为了克服这种缺点,可以通过构建包含同一病毒不同基因的嵌合基因片段的表达载体,导入植物,既可以提高抗性水平,又能增强对同一病毒不同分离物抗性范围及抗性遗传的稳定性。本研究基于RNAi的原理,同时为了克服因病毒突变造成的抗性逃逸,培育了高抗、广谱并且稳定遗传的转基因水稻。 首先改造了pCAMBIA1300表达载体,加入了玉米泛素蛋白基因Ubi启动子,胭脂碱合成酶基因3′端Nos终止子,将选择标记基因Hygromycin B替换为生物安全性更高的Bar基因,构建了新的表达载体pUNB。利用RSV-SD-JN2的CP、SP基因部分片度构建了包含CP/SP嵌合基因及单CP、单SP基因的RNAi载体p1300CP/SP p1300CP、p1300SP;冻融法导入农杆菌EHA105,利用农杆菌介导的转化方法,转化水稻豫粳6号愈伤组织,分别获得了TO代转基因植株23、24和17棵。 自交结实获得T1代株系,每个载体的T1代转基因株系各选取100棵,用来自山东济宁和江苏淮安RSV分离物接种,病毒抗性的检测结果显示:转化p1300CP/SP的转基因株系中有CS1、CS3、CS6、CS7、CS10、CS13、CS15、CS16、CS19株系,转化p1300CP的转基因株系中有CP1、CP3、CP4、CP7、CP9、CP12株系转化,p1300SP的转基因株系中中有SP2、SP5、SP6、SP7、SP13株系对两种病毒分离物的感病率都在6%以下,远远低于转化空载体转基因株系野生型株系的感病率,表现为抗性株系。三个载体其余株系的感病率都在12%以上,表现为中抗和感病株系。表明p1300CP/SP、p1300CP、p1300SP的T1代转基因株系中抗病株系的比率分别为39.13%、25.00%、29.41%。含CP/SP嵌合基因的转基因株系的抗病性和广谱性要好于转化单CP基因和单SP基因的转基因株系,说明同时干扰RSV多个基因的表达,可以更加有效的抵御RSV病毒的入侵,并且对不同地区分离物具有广谱抗性。 T1代抗性株系的Southern杂交显示,外源基因以不同拷贝整合于水稻的基因组中,并进行了有效表达,且转基因植株的抗病性与转基因的拷贝数之间无明显的相关性;T1代抗性株系的总RNA和siRNA的Northern杂交显示,抗病植株中RNA的积累量明显低于同类型的感病植株,转基因植株中有siRNA存在,表明病毒抗性是由RNAi引发的。 选取转化p1300CP/SP、p1300CP、p1300SP载体的T1代单拷贝抗性植株CS1、CS6、CP1、CP3、CP9、SP5、SP7进行T2代遗传分析,结果表明,转基因及其介导的抗性可以稳定的遗传至T2代,并且获得CSl和CP9两个不在发生分离的纯合体株系。
【学位授予单位】:山东农业大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2011
【分类号】:S435.111.4

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【参考文献】
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