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《山东农业大学》 2011年
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超长链多不饱和脂肪酸合成相关酶基因的克隆与鉴定及其在作物中的异源合成

孙全喜  
【摘要】:超长链多不饱和脂肪酸(very long chain polyunsaturated fatty acids,VLCPUFAs),比如花生四烯酸(AA,20:4Δ5,8,11,14)、二十碳五烯酸(EPA,20:5Δ5,8,11,14,17)和二十二碳六烯酸(DHA,22:6Δ4,7,10,13,16,19)对人体营养和健康具有重要的意义。其中,EPA、DHA是鱼油的主要有效成分。目前,该类脂肪酸的主要来源是深海鱼油。但由于海洋鱼类捕捞量的下降以及环境污染等原因导致鱼油的产量和质量无法满足人类的需求。因而,寻找更为经济、稳定、安全、可持续的EPA和DHA来源成为当务之急。利用基因工程的方法,将EPA/DHA合成途径重组到高等植物中,从而在高等植物,特别是油料作物中生产鱼油,将是一条鱼油的新来源。 本文分别在富含EPA或DHA的球等鞭金藻、马铃薯致病疫霉和强壮前沟藻中,克隆并鉴定了EPA/DHA合成途径中的去饱和酶基因四个;开发了一种新的多基因表达载体构建方法;并利用该方法,成功将EPA合成途径中的五个关键酶基因串联在一个表达载体中,并对高等植物进行了遗传转化。PCR证明转基因植株含有相应基因,并检测到了AA和EPA在这些植株中的生成。主要结果如下: (1)球等鞭金藻Δ5去饱和酶基因的克隆及功能鉴定 我们利用RACE的方法在球等鞭金藻cDNA文库中同源克隆到一个大小为1329bp的cDNA片段,编码442个氨基酸的多肽,分子量约49.9kDa。生物信息学分析表明,其编码产物具备去饱和酶所具有的N端细胞色素b5结构域,以及与电子传递有关的三个富含组氨酸的结构域,与来源于另一海洋微藻Pavlova salina的Δ5去饱和酶同源性最高,达56%,故将该基因命名为IgD5。酿酒酵母功能鉴定实验表明,其编码的蛋白质能够将二高-γ-亚麻酸(DGLA,20:3Δ~(8,11,14))转化成花生四烯酸(AA,20:4Δ~(5,8,11,14)),具有Δ5去饱和酶活性,并且具有底物专一性。 (2)马铃薯致病疫霉Δ6、Δ5和Δ12去饱和酶基因的克隆及功能鉴定 利用生物信息学的方法,从近来完成测序的马铃薯致病疫霉的基因组数据库中搜索到三个可能分别编码Δ6去饱和酶(PinD6)、Δ5去饱和酶(PinD5)以及Δ12去饱和酶基因(PinD12)的序列,利用RT-PCR的方法,在马铃薯致病疫霉cDNA中对它们进行扩增,得到分别长1197、1371和1551bp的开放阅读框,分别编码398、456和516个氨基酸。这三个去饱和酶都具有一般去饱和酶所具备的三个组氨酸框结构域,其中,PinD6和PinD5还具备front-end去饱和酶细胞色素b5结构域。酿酒酵母功能鉴定实验表明:PinD6编码的蛋白质能够将亚油酸(LA,18:2Δ~(9,12))和亚麻酸(ALA,18:3Δ~(9,12,15))分别转化成γ-亚麻酸(GLA,18:3Δ~(6,9,12))和十八碳四烯酸(SDA,18:4Δ~(6,9,12,15));PinD5编码的蛋白质能够将二高-γ-亚麻酸(DGLA,20:3Δ~(8,11,14))转化成花生四烯酸(AA,20:4Δ5,8,11,14);PinD12编码的蛋白质能够将脂肪酸16:1Δ9和油酸(OA,18:1Δ9)分别转化成16:2Δ~(9,12)和亚油酸(LA,18:2Δ~(9,12)),分别具有Δ6去饱和酶、Δ5去饱和酶以及Δ12去饱和酶活性。并且这三个酶都具有很好的底物专一性。结合以前已经克隆到的Δ17去饱和酶和Δ6链延长酶以及马铃薯致病疫霉脂肪酸的分布,我们推断马铃薯致病疫霉中AA和EPA可能主要是通过ω6/Δ6途径来实现的。 (3)强壮前沟藻中DHA合成相关基因的克隆 我们对富含DHA(~12%)的强壮前沟藻的转录组进行了测序,分析并获得了可能的去饱和酶基因EST序列4个和链延长酶基因的EST序列5个,并进一步利用RACE的方法,获得了全部序列的3′端,以及编号为AcD20的一个特异的超长链多不饱和脂肪酸去饱和酶的全长序列,其功能正在检测中。 (4)多基因表达载体构建方法的开发 我们发明了一个新的多基因表达载体构建的方法。该方法需要一个辅助载体,辅助载体具有-XbaI-MCS-AvrⅡ-XbaI-的结构,其中,XbaI和AvrⅡ是同尾酶。目的片段分别克隆到辅助载体的多克隆位点MCS上。方法原理如下:将目的片段1、2、3…分别亚克隆到辅助载体中,得到含有(-XbaI-片段1-AvrⅡ-XbaI-)、(-XbaI-片段2-AvrⅡ-XbaI-)、(-XbaI-片段3-AvrⅡ-XbaI-)…等一系列质粒。由于XbaI和AvrⅡ是同尾酶,二者酶切后可获得相同的粘性末端。将片段2在质粒(-XbaI-片段2-AvrⅡ-XbaI-)中用XbaI切下,连接到经AvrⅡ线性化的质粒(-XbaI-片段1-AvrⅡ-XbaI-),鉴定方向后,获得带有目的片段1和2的质粒(-XbaI-片段1-(?)–片段2-AvrⅡ-(?)-XbaI-),而新形成的(?)和(?)不能够再被XbaI或AvrⅡ切开。同时随着片段2的加入,又添加了一个新的AvrⅡ酶切位点,因而可以相同方式接受目的片段3的插入。我们构建了四个辅助载体pAUX1、pAUX2、pAUX1GW和pAUX2GW,并成功的将GUS、GFP和BAR基因的表达盒及两个TM2序列串联在一起,并在拟南芥中检测到了三个基因的表达,首先验证了此方法的可行性。 (5)EPA在作物中的异源合成 我们构建了含有四个脂肪酸去饱和酶基因和一个链延长酶基因的用于生产EPA的植物表达载体pCamBAR-5EC,用农杆菌侵染的方法对玉米、棉花和花生等农作物进行了遗传转化。初步获得了PCR检测为阳性的转基因玉米和棉花植株,并在玉米叶片中检测到了AA和EPA的存在。目前,棉花中的AA和EPA等脂肪酸情况正在检测中。
【学位授予单位】:山东农业大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2011
【分类号】:Q78

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【引证文献】
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【同被引文献】
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